缺氧诱导因子-1α在子宫内膜异位症患者子宫内膜的表达及意义

代满荣　洛若愚

luruoyu1018@126.com



缺氧诱导因子-1α在子宫内膜异位症患者子宫内膜的表达及意义

代满荣1,2洛若愚1，*

luruoyu1018@126.com

【摘要】目的：观察分析缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在子宫内膜异位症(简称内异症)患者子宫内膜细胞的表达及意义。方法：收集不同r-AFS分期子宫内异症患者(内异症组，n=35)和同期子宫肌瘤患者(对照组，n=40)子宫内膜组织标本，应用免疫组织化学(SP)技术检测各组(期)HIF-1α的表达情况，分析组间差异及与r-AFS分期的相关性。结果：子宫内异症组异位、在位子宫内膜HIF-1α阳性表达率分别为82.86%和77.14%，均明显高于对照组子宫内膜(52.50%)(χ2=7.741、4.920,P均<0.05)，且子宫内异症组子宫内膜HIF-1α阳性表达率随r-AFS分期提高而升高(r= 0.363，P<0.05)。结论：HIF-1α表达上调可能与子宫内异症的发生发展有关。

【关键词】子宫内膜异位症； 缺氧诱导因子-1α

子宫内膜异位症(简称内异症)是妇科常见病、多发病，是导致生育期妇女慢性腹腔痛、不孕的常见原因之一，约有8%-10%的生育期妇女患有此病[1]。子宫内异症的病因及发生机制目前仍不明确，研究[2]提示，血管生成在子宫内异症形成和发展中具有重要作用，但是子宫内膜异位病灶如何获得血管生成能力目前还不清楚。缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible Factor-1，HIF-1α)是机体缺氧状态的关键调节转录因子，通过促进血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、血管生成素(Angiogenin，Ang)、血小板生长因子(Platelet Growth Factor，PGF)等的表达，对异位子宫内膜的血管生成发挥重要作用[3，4]。本文采用免疫组织化学技术检测不同程度子宫内异症患者异位子宫内膜、在位子宫内膜HIF-1α的表达情况，并分析其临床意义。

1资料与方法

1.1病例和分组

2012-10—2013-12在本院行子宫内异症手术治疗患者(内异症组，n=35)，根据病检结果并参照美国生育学会内异症分期标准(Revised Classification of American Fertility Society，r-AFS)[5]分为Ⅰ期(n=2)、Ⅱ期(n=8)、Ⅲ期(n=16)、Ⅳ期(n=9)。另选同期子宫肌瘤全切术患者作为对照组(n=40)。纳入标准：(1)内异症组均为原发性子宫内异症患者，经病理检查确诊；对照组既往均无子宫内异症或其它子宫内膜疾病。(2)两组患者均无内分泌疾病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤及严重肝、肾疾病；(3)两组患者术前3个月未使用激素类药物。两组患者年龄、初潮年龄、月经期别、人工流产次数、分娩次数等一般情况差异无统计学意义(t值0.6-1.1，P>0.05)，见表1。收集标本前，所有患者均知情同意。

表1　两组一般情况比较±s)

1.2标本采集和制片

快速切取同一子宫内异症患者异位和在位子宫内膜以及对照者正常子宫内膜组织，大小约1cm×1cm×1cm，立即用生理盐水轻轻清洗表面血渍，10%福尔马林固定24h后常规方法脱水、包埋、切片(厚约4μm)。

1.3免疫组化染色

1.3.1主要试剂：兔抗人HIF-1α多克隆抗体购自武汉谷歌生物工程有限公司(货号：BA1231-3), DAB显色试剂盒购自美国Sigma公司(货号：1262159)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自碧云天公司,中性树胶购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3.2免疫组化染色方法：依照SP 试剂盒说明书，先置切片于65℃烘箱中烘片2h，再常规脱蜡至水化，微波加热90s修复抗原，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭20min，一抗湿盒4℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；同时以PBS代替一抗作阴性对照，显微镜观察结果。

1.3.3结果判定：SP染色子宫内膜细胞胞浆呈淡棕色为弱阳性，棕色为阳性，棕褐色为强阳性[6]。光学显微镜下每张切片随机选择10个高倍视野，结合染色强度和阳性细胞数量取均值作为1例标本结果纳入各组进行比较分析。观察结果分为4级：(1)阳性细胞数<1%，且染色强度弱阳性为HIF-1α表达阴性；(2)阳性细胞数1%-10%，且>50%细胞染色强度弱阳性为HIF-1α表达弱阳性(+)；(3)阳性细胞数10%-60%，且>50%细胞染色强度弱阳性至强阳性为HIF-1α表达阳性(++) ；(4)阳性细胞数>60%，且50%以上细胞染色强度阳性至强阳性为HIF-1α表达强阳性(+++)。每组HIF-1α 阳性表达率的计算方法为每组(每期)SP结果(+)-(+++) 的细胞数占该组(期)标本总细胞数的百分比。

1.4统计学处理

2结果

2.1各组HIF-1α表达阳性率

HIF-1α在对照组和内异症组子宫内膜均有表达，内异症组异位患者强阳性表达，主要见于胞浆内，呈棕褐色、弥漫性或灶状分布(图1A)，内异症组在位患者为阳性表达，呈棕色、弥漫性分布(图1B)；对照组子宫内膜为弱阳性表达，呈淡棕色、散在分布(图1C)。定量分析其阳性表达率，内异症组异位内膜与在位内膜HIF-1α阳性率分别为82.86%和77.14%，均显著高于对照组(χ2=7.741,P<0.01；χ2=4.920,P<0.05)，异位内膜和在位内膜HIF-1α阳性表达率差异无统计学意义(χ2=0.357,P>0.05)。见表2。

2.2内异症患者HIF-1α表达与r-AFS分期的关系

内异症Ⅰ期—Ⅳ期，HIF-1α表达率从50.00%升高到88.89%，明显表现为随r-AFS分期提高，HIF-1α表达逐渐增强。两变量呈显著正相关(r=0.363，P<0.05)。见表3。

表2　内异症组和对照组HIF -1α阳性表达率比较

注：与对照组比较，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　r-AFS不同分期内异症患者HIF -1α表达阳性率

[本文图1-图3见封3]

3讨论

子宫内异症指具有生长能力的子宫内膜腺体和间质在子宫腔以外部位生长引起的，以继发性进行性痛经、慢性盆腔痛和不孕为主要临床表现的激素依赖性妇科疾病，其发病机制仍不完全清楚。在较多机制学说如种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、免疫学说中，目前更多倾向于种植学说，即子宫内膜组织随逆流的经血通过输卵管进入盆腔及腹腔, 在局部细胞及细胞因子的参与下，逃避免疫清除并存活，继而黏附、侵袭局部组织，形成异位病灶。HIF在此过程中扮演重要角色。

HIF-1是由HIF-1α和 HIF-β两个亚基组成的异源二聚体[7]，其中HIF-1α既是活性亚基又是调节亚基，在机体缺氧情况下，通过与低氧反应元件(Hypoxia Response Element，HRE)结合，调节下游靶基因的转录过程，涉及细胞凋亡、增殖、血管生成、能量代谢及红细胞生成等诸多方面[8]。大量研究[9-12]表明HIF-1α在肿瘤的血管生成、侵袭和转移等多种病理过程中发挥重要作用。子宫内异症虽属良性疾病，但其增殖、浸润、转移及复发等病理行为类似恶性肿瘤，HIF-1α在子宫内异症中的作用也受到广泛关注。张晓梅等[13]报道50例子宫内异症患者在位、异位子宫内膜VEGF及CD31的表达显著高于正常子宫内膜。Lu等[14]观察到不同浓度氧预处理的内异症在位子宫内膜移植到SCID小鼠，即重症联合免疫缺陷综合症( Severe Combined Immune Deficient Disease)小鼠后，发现低氧预处理能促进子宫内膜异位灶的增殖和血管生成相关标志物如细胞增殖抗原标记物(Ki67)、血小板内皮细胞黏附分子(Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1,PECAM-1,又称CD31)、VEGF、HIF-1α表达上调，而高氧预处理则有抑制作用。Critchley等[15]研究发现HIF-1α在正常子宫内膜的表达量在分泌晚期和月经期最大。 Goteri等[16]在子宫内异症患者异位灶局部检测到HIF-1α表达量显著高于正常子宫内膜组织。这些结果均表明内异症的发生发展与促血管因子表达上调和血管生成有关，HIF-1α可能在其中起到促进作用。

本文样本的对照组子宫内膜、在位及异位子宫内膜均被检测到HIF-1α蛋白的表达，且异位内膜及在位内膜的HIF-1α表达显著高于对照组内膜，与上述报道相一致。内异症患者在位内膜组织中增高的HIF-1α可能一方面通过其促增殖和抗凋亡作用[17]增加脱落内膜组织在异常部位的存活能力；另一方面上调VEGF的表达[18]而为其在异常部位种植生长提供血管支持。进一步分析内异症不同r-AFS分期患者异位灶局部HIF-1α的表达结果发现，随着r-AFS分期的提高，HIF-1α的表达逐渐增强，两者呈显著正相关。提示HIF-1α不仅参与子宫内异症的发生，可能还促进其进展，如进一步加重局部纤维化和异位灶内缺氧，进一步加重局部炎症，使非低氧诱导的HIF-1α增加；增加的HIF-1α又进一步促进异位内膜组织的增殖、侵袭能力，使内异症病变不断发展和恶化。

总之，HIF-1α表达增加可能是子宫内异症发生发展的重要机制之一，理论上或可作为子宫内异症治疗新靶点，但临床可行性有待进一步论证。

◀

代满荣(1975-)，女，汉族，硕士研究生，副主任医师，主要从事妇产科临床工作

参考文献

1Sohn VY, Arthurs ZM, Martin MJ, et al. Incidental pathologic findings in open resectional gastric bypass specimens with routine cholecystectomy and appendectomy[J]. Surg Obes Relat Dis, 2008,4(5): 608-611.

2Yildiz C, Kacan T, Cetin A, et al. Effect of imatinib on growth of experimental endometriosis in rats[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2016,2(197):159-163.

3Goteri G, Lucarini G, Zizzi A, et al. Proangiogenetic molecules, hypoxia-inducible factor-1alpha and nitric oxide synthase isoforms in ovarian endometriotic cysts[J]. Virchows Arch, 2010, 456(6):703-710.

4王春红,魏静波,曲银娥,等.血管内皮生长因子及其受体在子宫内膜异位症中的表达和意义[J].中国免疫学杂志，2013，29(6):605-609.

5American Fertility Society．Revised American Fertility Society classification of endometriosis: 1985[J]. Fertil Steril, 1985, 43(3):351-352.

6郭君丽,张永利. 子宫内膜异位症患者子宫内膜组织MMP-9、AQP5的表达及意义[J].山东医药,2014, 54(6):82-83.

7Wang GL, Semenza GL. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1[J]. J Biol Chem,1995, 270(3):1 230-1 237.

8Semenza GL, Nejfelt MK, Chi SM, et al.Hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer element located 3' to the human erythropoietin gene[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991, 88(13):5 680-5 684.

9Li J, Mi C, Ma J, et al. Dihydrotanshinone I inhibits the translational expression of hypoxia-inducible factor-1α[J]. Chem Biol Interact,2015, 240(5):48-58.

10El-Naggar AM, Veinotte CJ, Cheng H, et al. Translational activation of HIF1α by YB-1 promotes sarcoma metastasis[J]. Cancer Cell,2015, 27(5):682-697.

11赵鹏,郑贸根,程光,等.LOX与HIF-1α在非小细胞肺癌中表达增强[J]. 基础医学与临床,2015, 35(6):776-780.

12倪小晴,张佐阳,吴继锋. HIF-1α蛋白在胃癌中的表达及其与Wnt信号通路、上皮-间质转化的关系[J].临床与实验病理学杂志,2014, 30(2):140-144.

13张晓梅,郭欢,任艺婷,等. VEGF和CD31在子宫内膜异位症组织中的表达及其意义[J]. 中国药物与临床,2014, 14(7):895-896.

14Lu Z, Zhang W, Jiang S, et al. Effect of oxygen tensions on the proliferation and angiogenesis of endometriosis heterograft in severe combined immunodeficiency mice[J].Fertil Steril,2014,101(2):568-576.

15Critchley HO, Osei J, Henderson TA, et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha expression in human endometrium and its regulation by prostaglandin E-series prostanoid receptor 2 (EP2) [J].Endocrinology,2006, 147(2):744-753.

16Goteri G, Lucarini G, Zizzi A, et al.Proangiogenetic molecules, hypoxia-inducible factor-1alpha and nitric oxide synthase isoforms in ovarian endometriotic cysts[J].Virchows Arch,2010, 456(6):703-710.

17Sendoel A, Kohler I, Fellmann C, et al.HIF-1 antagonizes p53-mediated apoptosis through a secreted neuronal tyrosinase[J].Nature,2010, 465(7298):577-583.

18Rey S, Semenza GL. Hypoxia-inducible factor-1-dependent mechanisms of vascularization and vascular remodeling[J]. Cardiovascular Research,2010, 86(2):236-242.

The Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α in the Endometrium of Patients with Endometriosis

DAI Man-rong1,2LUO Ruo-yu1，*

1Department of Gynecology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060, China;2Department of Obstetrics and Gynecology, Xiantao People’s Hospital , Xiantao 433000, China;*Corresponding authors

【Abstract】Objective: To study the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium of patients with endometriosis.Method: The specimens were gathered from endometrium of 35 patients with endometriosis and 40 cases with hysteromyoma as control group. 35 cases with the endometriosis were staged according to the revised American Fertility Society System. Immunohistochemistry SP method was performed to examine the expression of hypoxia inducible factor-1α protein in the endometrium and the results were analyzed statistically.Results: The positive rates of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue were 82.86% and 77.14% respectively, which were significantly higher than that in control group (52.50%). There were statistical differences between the expression of hypoxia-inducible factor-1α protein in ectopic and eutopic endometria tissue and that in control group (χ2=7.741, χ2=4.920,P<0.05). The expression of hypoxia-inducible factor-1α protein was significantly positively correlated with r-AFS stage (r=0.363，P<0.05).Conclusion: The up-regulation of hypoxia-inducible factor-1α protein expression was possibly relevant to the development of the endometriosis.

【Key words】Endometriosis；Hypoxia inducible factor-1α

[中图分类号]R711.71

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)02-0014-04

第一作者简介：本文

本文2015-12-16收到，2016-02-19修回