喉鳞状细胞癌患者视网膜母细胞瘤蛋白和细胞周期调节蛋白D1异常表达

曾汉荣　杨虹女　李文星　涂　兴　李志华　孔维佳



喉鳞状细胞癌患者视网膜母细胞瘤蛋白和细胞周期调节蛋白D1异常表达

曾汉荣1杨虹女1李文星2涂兴3李志华2孔维佳3

【摘要】目的：探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)患者视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)和细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)的异常表达及其相关性。方法：选择36例喉部疾病手术患者，包括LSCC(LSCC组)、声带息肉(息肉组)和癌前病变(癌前组)各12例，各组均于手术后取病变组织，采用Western-blotting检测pRb和Cyclin D1蛋白表达水平，统计学分析各组两指标差异及相关性。结果：与息肉组比较，癌前组pRb表达水平降低(P<0.01)，Cyclin D1表达水平升高(P<0.01)；与癌前组比较，LSCC组pRb水平更低(P<0.01)，Cyclin D1水平更高(P<0.01)。三组pRb与Cyclin D1蛋白水平均呈显著负相关(r分别为-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。结论：LSCC的发生和发展与pRb表达降低和Cyclin D1表达增加有关。

【关键词】喉鳞状细胞癌；视网膜母细胞瘤蛋白；细胞周期调节蛋白D1

喉癌(Laryngeal Carcinoma, LC)是耳鼻咽喉-头颈外科常见恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的5.7%-7.6%，以喉鳞状细胞癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma, LSCC)最多，约占LC的96%-98%，死亡率高[1]。吸烟、酗酒、环境污染、病毒感染等多种因素是LSCC发生的主要原因，其分子生物学机制可能与原癌基因的激活及肿瘤抑制基因失活、转录失调等密切相关[2]。视网膜母细胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein, pRb)是一种重要的肿瘤抑制因子，在多种肿瘤中发生突变或缺失[3]，当致瘤RNA取代转录因子E2f，占据pRb口袋时，即破坏pRb正常功能，削弱pRb/E2f调控细胞增殖作用。细胞周期调节蛋白D1(Cyclin D1)是一种生长因子感受器和细胞周期正向调控因子[4]，负责细胞周期进展中G1/S转换，一旦Cyclin D1表达异常上调，组织细胞生长会无序增加。研究认为LSCC可能与pRb抑癌功效降低和/或Cyclin D1表达上调密切相关[5]。但目前有关pRb/Cyclin D1在LSCC发生中表达程度和相关性的报道较少。本实验采用Western-blotting技术检测LSCC、声带息肉(Vocal Cord Polyp, VCP)和癌前病变(Laryngeal Precarcinoma Lesions，LPL)组织的pRb和Cyclin D1表达水平并分析其相关性，探讨pRb和Cyclin D1对LSCC发病机制的作用及对临床诊断和治疗的意义。

1资料与方法

1.1临床标本和分组

2014-05—2015-05在枝江市人民医院耳鼻咽喉科住院，经电子喉镜、颈部MRI增强扫描、颈部及腹部超声和喉部病变组织活检等常规检查后，确定手术治疗患者36例，分别接受喉部手术，摘除病灶组织迅速用生理盐水冲洗，去除血迹，旋即用无菌手术刀切取病变组织的中心部位后平分为二，一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，HE染色，由三位经验丰富的病理科医师进行组织形态学镜检；另一部分立即置于-80℃液氮冻存，待检pRb和Cyclin D1表达水平。组织病理学明确诊断36例样本中LSCC 12例(LSCC组，男9例，女3例，年龄42-79岁，平均60.50±12.30岁；且既往无喉部手术史；手术前没有接受任何放疗、化疗或免疫治疗；不伴不典型增生；无并发其它癌症及急慢性疾病史)，声带息肉12例(息肉组，男7例，女5例，年龄40-65岁，平均52.50±9.60岁)，癌前病变12例(癌前组，分别为喉角化病、喉黏膜白斑病、疣状增生等，男9例，女3例，年龄57-77岁，平均67.00±10.20岁)。三组性别、年龄比较差异无统计学意义(P均>0.05)。本实验经枝江市人民医院伦理委员会批准，并遵循患者知情同意原则。

1.2主要实验仪器和试剂

1.2.1仪器：高速台式低温离心机(MMLT-XIR，Thermo公司，美国)；-80℃超低温冰箱(MDF-U53V，Sanyo公司，日本)；酶标仪(Synergy HF，Bio-tek公司，美国)；垂直电泳仪(PowerPacTM HC, Bio-Rad公司，美国)；Western Blot转移电泳仪(XCell SureLock， Invitrogen公司，美国)；双通道荧光扫描仪(ODY-2182，Li-Cor公司，美国)；紫外凝胶成像系统(VL，Vilber公司，法国)；Teflon梳子，NC膜和Wortman滤纸等。

1.2.2试剂：兔抗人pRb和Cyclin D1单克隆抗体均购自美国Epitomics公司(批号：20150605)；二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司(货号：8817-423)；溴酚蓝、蛋白质电泳Marker、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗人单克隆抗GAPDH抗体(批号：20151423)、考马斯亮蓝G-250、丙烯酰胺、TBST缓冲液、脱脂奶粉均购自美国sigma公司；T-Per组织蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂等购自美国Pierec或Roche公司。

1.3Western-blotting技术检测组织pRb/Cyclin D1蛋白表达

从-80℃冰箱中取出标本，加入10g组织样本到冰凌包绕的预存有1ml组织蛋白裂解液和20μl蛋白酶抑制剂的EP管中(10mg/100μl组织裂解液)，用匀浆器匀浆，12 000rpm和4℃条件下离心5min后，置于4℃条件下保存10min待用。应用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白质浓度。蛋白表达检测用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，通过灌胶、上样(Marker和待测提取液各50μl)、电泳，获得带有蛋白条带的分离胶。在分离胶上标记方向，用一张NC膜和两张Wortman滤纸按滤纸-凝胶-NC膜-滤纸平铺于支撑垫上转膜2h，完成后将NC膜置于TBST缓冲液浸洗5min，再放于含5%脱脂奶粉的膜封闭液中振荡2h。分别加入适量兔抗人pRb和Cyclin D1单克隆抗体(各为1∶200)以及兔抗人单克隆抗GAPDH抗体(内参照)，振荡后温育2h，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶5 000)

温育1h， DAB显色，用紫外凝胶成像系统扫描和摄像，将目的蛋白电泳条带与GAPDH条带在同一张膜上比较后拟合绘图和定量分析，两者积分光密度(OD)比值分别代表pRb和Cyclin D1表达水平。

1.4统计学处理

2结果

息肉组、癌前组和LSCC组pRb蛋白和Cyclin D1蛋白差异均有统计学意义(P<0.01)。pRb蛋白表达依次降低，LSCC组最低；而Cyclin D1蛋白表达依次升高，LSCC组最高。两两比较，癌前组pRb积分OD比值明显低于息肉组(t=8.31,P<0.01)，LSCC组更低于癌前组(t=7.17,P<0.01)。癌前组Cyclin D1蛋白表达高于息肉组(t=5.19,P<0.01)，LSCC组高于癌前组(t=3.28,P<0.01)。结果见图1和表1。相关性分析显示，各组pRb与Cyclin D1的蛋白表达均呈显著负相关(r分别为-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。

图1　不同病变组织pRb和Cyclin D1的表达

组 别pRbCyclinD1息肉组1.95±0.380.28±0.17癌前组1.09±0.291)0.86±0.331)LSCC组0.32±0.092)1.78±0.632)F值36.7862.51

注：与息肉组比较，1)P<0.01；与癌前组比较，2)P<0.01

3讨论

喉癌中，以发生于喉腔黏膜上皮组织的LSCC最常见，好发于50-70岁人群，男性多于女性[6]。LSCC是一种细胞周期紊乱性疾病，分子生物学机制可能与原癌基因激活及肿瘤抑制基因失活、转录失调等基因表达异常密切相关[2]。在细胞形态发生明显变化之前，分子水平的癌基因与抑癌基因就可能已出现了异常变化，通过检测癌组织中相关蛋白表达，可为喉癌的早期发现和分子诊断提供量化依据[7]。

pRb是抑癌基因Rb的表达产物，在视网膜母细胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、大肠癌等多种肿瘤组织中表达异常，其缺失和突变均影响细胞增殖调控[8]。Cyclin D1是周期素蛋白家族关键蛋白，在细胞周期中发挥正性调节作用，当机体细胞中Cyclin D1拷贝数增加、染色体重排及基因多态性改变时，正常组织细胞新旧更替失去控制，可导致恶性肿瘤发生[9]。本文采用Western-blotting检测发现，LSCC患者pRb表达显著减少，Cyclin D1表达明显增加，异常程度均较息肉组织和癌前病变组织严重。表明LSCC发生后，处于细胞周期G1/S调控中心部位的pRb活性严重降低，而控制细胞增殖G1中期的关键蛋白Cyclin D1异常增加，最终造成肿瘤的发生和发展。pRb和Cyclin D1两种分子标志物的异常变化，可以为喉癌的早期发现和治疗提供靶标，将喉组织恶变趋势消除在萌芽状态[10,11]。

pRb和Cyclin D1表达水平检测为阐述LSCC发生机制提供了分子学证据，本文相关性分析显示，无论息肉组、癌前组和LSCC组，其pRb蛋白表达与Cyclin D1蛋白表达均呈显著负相关，提示LSCC的发生与pRb和Cyclin D1的此消彼涨关系密切。pRb抑癌功能失活和Cyclin D1调控细胞增殖加速，决定了喉部组织恶变的程度[12]，其作用机制可能为当患者喉部的宿主细胞遭受外来分裂刺激因素的激活和放大后，处于细胞分裂增殖G1/S调控点(G1/S Checkpoint)中心部位的pRb进行性减少，激活细胞周期控制蛋白Cyclin D1过表达，并与细胞周期依赖性激酶结合，磷酸化pRb，导致与pRb结合的转录因子E2F与pRb分离；而游离的E2F可充分发挥转录因子作用，激活有关基因，使喉组织细胞跨过G1/S checkpoint，由G1期向S期演进，引起细胞增殖。而且低磷酸化的pRb还可能刺激Cyclin D1转录、合成和活化，导致pRb更进一步磷酸化，从而在G1晚期形成一反馈环节，调节Cyclin D1进一步过度表达，阻断干扰素产生，增加外源DNA的整合及突变，抵抗细胞凋亡，使细胞永生化，最终造成喉组织细胞增殖失控而促进LSCC的发生[13]。

综上所述，LSCC 的发生和发展与细胞周期调控中心的pRb降低和Cylin D1增加密切相关，呈现显著负相关性。提示临床疑诊LSCC时，检测标本组织中pRb和Cyclin D1表达水平，有利于佐证临床诊断和分析发病原因及机制。而且癌前喉组织pRb和Cyclin D1表达的检测或可为LSCC的早期预防和治疗提供分子靶标。

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曾汉荣(1963—)，男，汉族，副主任医师，主要从事耳鼻咽喉-头颈外科疾病的临床防治

参考文献

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10张红凯,刘红刚.喉癌前病变的分类及其临床病理学研究现状[J]. 中华病理学杂志,2010,39(8):570-573.

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13Saini SS, Klein MA. Targeting cyclin D1 in non-small cell lung cancer and mesothelioma cells by antisense oligonucleotides[J]. Anticancer Res,2011,31(11):3 683-3 690.

The Abnormal Expressions of pRb and Cyclin D1 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Patients

ZENG Han-rong1, YANG Hong-nu1, LI Wen-xing2, TU Xing3, LI Zhi-hua2, KONG We-jia3

1Department of Otolaryngology, The People’s Hospital of Zhijiang City, Zhijiang 443200,China;2Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,China;3School of Life Science of Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China

【Abstract】Objective: To investigate the abnormal expressions of retinoblastoma protein (pRb) and cell cycle protein D1 (Cyclin D1) in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) patients.Method: All pathological specimens, which were respectively included 12 cases of LSCC group and vocal cord polyp (VCP group) as well as laryngeal precarcinoma lesions (LPL group) were selected from patients, who were accepted radical surgery treatments because of different diseases of laryngeal tissures. The expression of pRb and Cyclin D1 were detected by Western-blotting methods. Moreover, correlational difference between different proteins were analyzed and compared by used statistical software in the mentioned above three groups.Results: Compared with VCP group, the expression of pRb was markedly decreased (P<0.01), and the expression of Cyclin D1 was notably increased in LPL group (P<0.01). Compared with LPL group, however, the quantitative levels of pRb was furtherly decreased (P<0.01), moreover, the quantitative levels of Cyclin D1 was significenlly increased in LSCC group (P<0.01). The expression of pRb had significant negative correlation with that of Cyclin D1 with -0.94 in VCP group and -0.83 in LPL group as well -0.92 in LSCC group (P of all <0.001).Conclusion: The occurrence and development of patients with LSCC might have significant relationship with that pRb was severely decreased and Cyclin D1 was significantly increased.

【Key words】Laryngeal squamous cell carcinoma; Retinoblastoma protein; Cell cycle protein D1

[中图分类号]R739.65

[文献标识码]A

[文章编号]1005-1740(2016)02-0066-04

第一作者简介：本文

[作者单位]1湖北省枝江市人民医院耳鼻咽喉科， 枝江 443200；2武汉大学人民医院耳鼻咽喉-头颈外科，武汉 430060；3华中科技大学同济生命科学学院，武汉 430022

本文2016-02-02收到，2016-03-11修回