低频强声暴露后巴马香猪耳蜗caspase-3表达及毛细胞死亡观察

徐海艳　吴玮,　王刚　陈娜　张弛　屈昌北　王鸿南　李保卫　韩浩伦　周丽斌



·实验研究·

低频强声暴露后巴马香猪耳蜗caspase-3表达及毛细胞死亡观察

徐海艳1吴玮1,2王刚2陈娜2张弛2屈昌北2王鸿南2李保卫2韩浩伦2周丽斌2

【摘要】目的了解高强度低频噪声(下称：低频强声)暴露对巴马香猪耳蜗凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达的影响，同时观察耳蜗毛细胞死亡情况。方法将8只巴马香猪随机分为对照组2只及实验组6只；所有动物均于实验前行听性脑干反应(ABR)检测，然后将实验组随机分为噪声暴露后即刻组、36 h组及84 h组，每组各2只，分别暴露于50 Hz、142 dB SPL的噪声中5 min，于噪声暴露后相应时间点行ABR检测，用免疫组织化学染色和免疫荧光DAPI标记细胞核两种方法观察耳蜗组织中caspase-3的表达，同时通过细胞计数方法计算毛细胞缺失率判定细胞死亡情况。对照组不给予噪声暴露，其他条件与实验组相同。结果噪声暴露前8只巴马香猪的ABR平均阈值为61.25±10.72 dB nHL；低频强声暴露后实验组中的即刻组、36 h组和84 h组的动物双耳ABR均未引出；实验各组动物耳蜗各部位均可见caspase-3阳性表达，且随着暴露后时间延长，caspase-3阳性表达逐渐减弱；噪声暴露后即刻组、36 h组与正常对照组相比较，耳蜗三排外毛细胞排列及层次明显错乱；噪声暴露后84 h组耳蜗三排外毛细胞消失，仅可见一层内毛细胞；正常对照组及噪声暴露后即刻组、36 h组、48 h组耳蜗外毛细胞缺失率分别为0%、0%、14.06%、100%。结论低频强声暴露使巴马香猪听性脑干反应阈值较暴露前明显提高，随暴露后时间延长，耳蜗组织中caspase-3阳性表达减弱，毛细胞死亡数量明显增加，螺旋神经节区域也出现了细胞凋亡现象。

【关键词】低频强声；小型猪；毛细胞死亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

噪声普遍存在于我们生存的环境中，给人类生产、生活带来诸多的困扰，甚至可导致不同程度的听力损伤。研究[1]证实高强度低频噪声(下称：低频强声)暴露后大鼠耳蜗Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带均可见凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的阳性表达。目前，对低频强声致大型哺乳动物耳蜗损伤的研究较少，本研究拟通过观察低频强声对巴马香猪听功能的影响、耳蜗凋亡因子caspase-3的表达变化及耳蜗毛细胞死亡情况，探讨其导致大型哺乳动物耳蜗损伤的可能机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组实验动物为外耳道洁净且健康的巴马香猪8只(第三军医大学实验动物中心提供)，体重10～20 kg，雌雄各半，分为对照组2只，实验组6只(噪声暴露后即刻、36 h、84 h组各2只)。

1.2低频强声暴露方法低频强声发生设备由动力源、低频信号发射器、功率放大器和声源发生器组成(第三军医大学提供)。声源频率为50 Hz，强度为142 dB SPL，将实验组巴马香猪置于低频强声声场环境内，每只持续暴露5 min。对照组除不给予低频强声暴露外其他条件与实验组相同。

1.3听性脑干反应(ABR)检测实验组和对照组均于实验前检测ABR，实验组再于低频强声暴露后即刻、36 h及48 h分别测试ABR。ABR测试方法：动物经耳缘静脉注射3%戊巴比妥(1 mg/kg)麻醉后，在隔声静电屏蔽室内进行双耳ABR反应阈测试；颅顶正中接记录电极，测试耳为参考电极，鼻尖处为地极，单耳闭合声场给声。刺激声为短音，带通滤波为100～3 000 Hz，信号放大100 000倍，刺激重复率21.1次/秒，声刺激持续时间100 μs，间隔10 ms，叠加1 024次；刺激声强度从95 dB nHL开始，先以10 dB递减，接近反应阈时以5 dB递减，以刚引出可重复出现比较稳定的波V的刺激强度判断为ABR反应阈；如果95 dB nHL不能引出反应阈则默认其阈值为100 dB nHL。测试时注意动物保温。

1.4耳蜗标本制备将对照组及实验组各组动物按相应时间点行ABR测试后迅速断头取出听泡，挑出镫骨，暴露卵圆窗，4%多聚甲醛溶液固定，EDTA溶液脱钙40天(每天换液)；脱钙完成后统一时间行免疫组化染色及免疫荧光染色。

1.5免疫组化及免疫荧光染色试剂：抗caspase-3兔多克隆抗体(即ab4051,Abcam公司)，羊抗兔IgG(Abcam公司)。免疫组织化学染色法：将耳蜗石蜡包埋后切片、脱水；PBS溶液冲洗；2%双氧水去除内源性过氧化氢酶10 min，PBS溶液冲洗；BSA封闭；加抗caspase-3抗体(用PBS以1:100配比)，4 ℃过夜，PBS溶液冲洗；加入二抗(二抗试剂盒)1 h，PBS溶液冲洗；DAB显色，检测Corti器、螺旋韧带、螺旋神经节caspase-3的表达；以PBS溶液代替抗caspase-3抗体作为阴性对照，选择扁桃体组织切片(根据Abcam公司提供的ab4051说明书要求选择成人无炎性反应的肥大扁抗体组织为阳性对照)作为阳性对照。以内耳各部位(Corti器、螺旋韧带、螺旋神经节)出现与阳性对照相应的棕褐色颗粒判断为caspase-3阳性表达。

采用免疫荧光法检测耳蜗基底膜caspase-3的表达。步骤如下：在体视显微镜(日本，OLYMPUS,SZX10)下去除耳蜗骨蜗壳、膜蜗壳、螺旋韧带、前庭膜及盖膜。将基底膜与蜗轴分离，将基底膜放置于4%多聚甲醛溶液过夜，换成PBS溶液，置于0.01 mmol/L PBS冲洗3次，每次间隔10 min；10%山羊血清封闭，常温下30 min；抗caspase-3抗体以1:100和PBS配比，4 ℃过夜； PBS 10 min，共3次；羊抗兔二抗(浓度为1:200)避光孵育，室温1 h， PBS 10 min，共2次，30 min 1次，避光；加入DAPI溶液，室温10 min， PBS 5 min，3次，避光；甘油封片。Leica880荧光倒置显微镜(德国Leica公司，LSM880)给予蓝色及绿色激发光观察标本。阴性对照选用未经噪声暴露的巴马香猪(对照组)耳蜗基底膜，用PBS代替一抗进行孵育，其余步骤与上述处理相同。DAPI标记细胞核，细胞核缺失计为死亡的细胞，取耳蜗底回基底膜，于63倍共聚焦显微镜下取图并进行毛细胞死亡计数。

2结果

2.1对照组及实验组噪声暴露前后ABR反应阈比较两组巴马香猪噪声暴露前ABR反应阈为50～80 dB nHL，平均61.25±10.72 dB nHL；噪声暴露后各实验组ABR均未引出。

图1　正常对照组及噪声暴露后各组耳蜗Corti器、螺旋韧带、螺旋神经节caspase-3表达

正常对照组(a1、b1、c1)耳蜗Corti器、螺旋韧带及螺旋神经节未见caspase-3的表达；噪声暴露后即刻组(a2、b2、c2)、36 h组(a3、b3、c3)、84 h组(a4、b4、c4)耳蜗Corti器、螺旋韧带、螺旋神经节细胞质中可见caspase-3阳性表达，且各部位caspase-3表达水平依次逐渐减低

图2　正常对照组及噪声暴露后即刻组、36 h组、84 h组各组耳蜗免疫荧光染色底回外毛细胞中caspase-3表达

正常对照组(a)未见caspace-3表达；噪声暴露后即刻组(b)及36 h组(c)三排外毛细胞细胞质可见caspase-3阳性表达，即刻组(b)较36 h组(c)表达水平高；噪声暴露后84 h组(d)外毛细胞消失，内毛细胞仍存在且caspase-3表达阳性

图3　正常对照组及噪声暴露后各组耳蜗底回基底膜DAPI核染色图　正常组(a)，即刻组(b)，36 h组(c),84 h组(d)

2.2各组免疫组化染色耳蜗caspase-3表达情况正常对照组(图a1、b1、c1)耳蜗Corti器、螺旋韧带及螺旋神经节未见caspase-3的表达；实验组中噪声暴露后即刻组(图a2、b2、c2)、36 h组(图a3、b3、c3)、84 h组(图a4、b4、c4)耳蜗Corti器、螺旋韧带、螺旋神经节细胞质中均可见caspase-3阳性表达，且caspase-3表达水平依次逐渐减低；实验组同一时间点血管纹及螺旋神经节caspase-3阳性表达水平与Corti器、螺旋韧带相一致。

2.3各组免疫荧光染色观察caspase-3表达及毛细胞缺失率实验组中噪声暴露后即刻组(图2b)及36 h组(图2c)三排外毛细胞细胞质可见caspase-3阳性表达，即刻组caspase-3阳性表达水平较36 h组高；噪声暴露后84 h组(图2d)外毛细胞消失，内毛细胞仍存在且caspase-3表达阳性。

正常组(图3a)毛细胞缺失率为0%(0/68)，即刻组(图3b)毛细胞缺失率为0%(0/70)，36 h组(图3c)毛细胞缺失率为14.06%(9/64),84 h组(图3d)毛细胞缺失率为100%。正常对照组三排外毛细胞细胞核排列整齐，36 h组较正常对照组细胞核排列不规则且层次错乱；噪声暴露后84 h组三排外毛细胞消失，一排内毛细胞仍存在。

3讨论

噪声对听功能的危害是其最显著的影响[2,3]。与高频噪声相比，低频噪声具有衰减慢、声波长及较易穿透障碍物的特点[4]，目前研究显示高强度低频率噪声暴露可使大鼠[5]、豚鼠[6]听性脑干反应阈明显提高，同时激活了诱导细胞凋亡的关键性蛋白酶凋亡因子caspase-3[1]；王建军等[6]发现经100 Hz、130 dB SPL噪声暴露后豚鼠的听力发生大约20 dB的暂时性阈移，1天后其听力有所恢复；既往研究[5]发现暴露于150 dB、100 Hz噪声环境10 min后大鼠听力下降，阈移大于60 dB，噪声暴露后随着时间的推移阈移逐渐减小。文中结果显示实验组巴马香猪暴露于50 Hz、142 dB SPL低频强声5 min后ABR均不能引出，阈移大于30 dB。可见低频强声所产生的听损伤随着噪声强度增加听损伤加重。

噪声导致听力损伤的机制一直受到学界的普遍关注。现有研究普遍认为[1]噪声暴露可以导致耳蜗外毛细胞的坏死和凋亡，且以凋亡为主。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)可诱导细胞凋亡，经上游caspase家族蛋白激活，介导相应底物(即有关DNA)的切割[7]；caspase-3是哺乳动物细胞凋亡的关键性蛋白酶[8]。从本研究结果看低频强声暴露后实验组动物耳蜗基底膜上三排外毛细胞中均可见caspase-3的阳性表达；同时免疫荧光及免疫组化两种方法均可见噪声暴露后即刻组caspase-3表达水平最高，随着低频强声暴露后时间延长其表达水平逐渐下降，与既往关于低频强声对大鼠听功能影响的研究结果[1]一致，可见随着暴露后时间延长低频强声所致的凋亡程序诱导水平逐渐降低。

螺旋神经节是听觉中枢的传入神经元，它的损伤程度直接反映了听功能的受损程度，噪声对螺旋神经节的损伤有的继发于毛细胞死亡[9]，有的则在毛细胞没有损伤的情况下出现了螺旋神经节的变形、消亡[10]。本实验中可见低频强声暴露后实验组耳蜗螺旋神经节细胞中caspase-3阳性表达，且与同组Corti器、螺旋韧带表达相一致，表明低频强声在对毛细胞造成影响的同时可诱导螺旋神经节细胞的凋亡，这一结果和薛秋红[11]观察的强噪声对豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡影响的研究结果一致。

本实验通过DAPI染核的方法观察到与正常对照组相比较，低频强声暴露后即刻组、36 h组三排外毛细胞排列及层次明显错乱；而噪声暴露后84 h组三排外毛细胞消失，仅可见一排内毛细胞；可见随着低频强声暴露后时间的延长毛细胞的死亡逐渐加重；此外，两种染色方法均可见随低频强声暴露后时间的延长耳蜗各区域caspase-3阳性表达逐渐减弱，考虑和caspase-3凋亡因子表达后所致的毛细胞死亡数量积累有关。细胞凋亡是细胞死亡的方式之一，caspase-3高表达说明细胞中凋亡进程活跃，细胞凋亡最终达到细胞死亡；推测随着噪声暴露后时间的推移毛细胞凋亡最终导致细胞死亡。但本实验尚不能得出低频强声所致毛细胞死亡是细胞凋亡或坏死的明确论断，噪声暴露后耳蜗毛细胞死亡的相关机制还有待今后进一步深入研究。

4参考文献

1尹志利,吴玮,王刚，等.低频强声对大鼠听力的影响及内耳caspase-3的表达[J].中华耳科学杂志,2014,12:503.

2岳振忠.职业性噪声听力损伤[J].工企医刊,2007,20:52.

3刘素香.中低频噪声对电力生产工人健康影响的调查研究[J].职业与健康,2003,19:3.

4孟苏北.城市住宅区低频噪声对人类健康的危害[J].中国医药导报,2007,4:17.

5王刚,吴玮,屈昌民,等.高强度低频稳态噪声对大鼠耳蜗形态和功能影响的研究[J].中华耳科学杂志,2014,12:360.

6王建军,冯勃.高强度低频噪声对豚鼠听力及耳蜗毛细胞的影响[J].中华耳科学杂志,2013,11:104.

7Laugwitz KL,Moretti A,Weig HJ,et al.Blocking caspase-activated apoptosis improves contractility in failing myocardium[J].Hum Gene Ther,2001,12:2051.

8Asakura T,Sawai T,Hashidume Y,et al. Caspase-3 activation during apoptosis caused by glutathione-doxorubicin conjugate[J].Br J Cancer,1999,80:711.

9王建军,毛华杰,董吕华，等.耳蜗毛细胞严重缺失后螺旋神经节细胞的病理变化[J].中华耳科学杂志,2013,11:593.

10Aage R,Moller L.Pure spiral ganglion cell loss in acoustic trauma[M].San Diego:Academic press,2001.404～407.

11薛秋红,陈佳,龚树生,等.强噪声暴露下豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡及caspase-3的表达[J].听力学及言语疾病杂志,2007,15:208.

(2015-07-20收稿)

(本文编辑李翠娥)

网络出版时间：2016-4-2615：53

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1553.022.html

The Observation of Cochlea Hair Cell Death and Expression of Caspase-3after Intense Low Frequency Noise Exposure in Bama Pig

Xu Haiyan*, Wu Wei, Wang Gang, Chen Na, Zhang Chi, Qu Changbei,Wang Hongnan, Li Baowei, Han Haolun, Zhou Libin

(*Medical College of PLA, Beijing,100853,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of intense low frequency noise on expression of caspase-3 in bama pigs, and observe the death of cochlea hair cell. Methods8 bama pigs were randomly divided into a normal control group(2 pigs) and experimental groups(6 pigs). Auditory brainstem responses(ABR) were tested before the experiment. The control group was the same as the experimental groups except noise exposure. The experimental group was randomly divided into immediate group,36 h group, and 84 h group(2 pigs per group). They were exposed to intense low frequency noise at 142 dB of 50 Hz for 5 min according to the three time points. ABR were tested again before the cochlea were collected at different time points. The expression of caspase-3 was studied through immunohistochemistry and immunofluorescence, hair cell loss rate by counting to determine cell death. ResultsThe average ABR threshold of 8 bama pigs(16 ears) before the exposure was 61.25±10.72 dB nHL. ABR thresholds were not elicited after exposure to the noise. Different parts of bama pigs showed positive expression of caspase-3in two ways. As time prolonged after exposure, the positive expression of caspase-3 gradually weakened. The immediate group and 36 h group, compared with the control group, showed the apparent misplace of three out hair cells in the arrangement and levels. The 84 h group through immunofluorescence lost out hair cells, and only inner hair cells were visible.ConclusionABR thresholds were elevated after noise exposure. The procedure of hair cell nucleus damage and caspase-3 expression is different, and the noise can induce opening apoptotic program of spiral ganglion.

【Key words】Low frequency noise;Swine;Hair cell death;Caspase-3

【中图分类号】R764.43+3

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2016)03-0256-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.009

作者简介：徐海艳，女，河南人，硕士研究生，主要研究方向为噪声性聋。通讯作者：吴玮(Email:entwuwei@126.com)

1解放军医学院(北京100853)；2解放军第306医院耳鼻咽喉头颈外科