软骨-软骨膜复合体重建鼓膜的组织学变化*

丁栋　许为青　汪银凤　万光伦



·实验研究·

软骨-软骨膜复合体重建鼓膜的组织学变化*

丁栋1许为青1汪银凤1万光伦1

【摘要】目的探讨软骨-软骨膜复合体修补鼓膜穿孔后其软骨厚度及软骨膜内血管密度的变化。方法45只雄性豚鼠随机分为A、B、C三组，每组15只，每只豚鼠分别于左侧耳制作鼓膜穿孔模型后立即采用同侧耳甲腔软骨-软骨膜复合体植入修补鼓膜，植入前先测量并记录植入复合体的厚度，分别观察术后2周(A组)、6周(B组)及12周(C组)植入复合体的厚度、软骨膜内血管密度；另取B组5只豚鼠的右耳(对照组)行鼓膜穿孔造模，不行鼓膜修补术。结果A、B、C三组豚鼠左耳鼓膜穿孔平均愈合时间为3.8±0.84天，对照组鼓膜穿孔自愈时间为7.2±0.84天；A、B、C三组软骨-软骨膜复合体植入前厚度分别为0.199±0.023、0.198±0.017、0.193±0.021 mm，三组间差异无统计学意义(P>0.05)，而植入后2周(A组)植入体厚度为0.227±0.024 mm,较植入前增厚，植入后6周(B组)植入体厚度为0.191±0.016 mm，较植入前无变化(P>0.05)，但较植入后2周(A组)变薄(P=0.016)，植入后12周的C组植入体厚度为0.169±0.017 mm，较植入前明显变薄(P<0.05)，且较植入后2周(A组)、6周(B组)厚度变薄(P=0.00)；植入后第2、6周，软骨膜单位面积中血管数量分别为13.28±2.49、7.71±2.49个，第2、6周时重建鼓膜的组织学结构为鳞状上皮层、纤维-软骨膜层、软骨层、粘膜层，第12周时为鳞状上皮层、软骨层及粘膜层。结论耳廓软骨-软骨膜复合体重建鼓膜的愈合时间短于鼓膜自行愈合的时间；植入后复合体的厚度较植入前先增厚再变薄，软骨膜层血管数量表现为先增加后减少；重建鼓膜最终组织学分层与正常鼓膜组织学结构相似。

【关键词】鼓膜穿孔；软骨-软骨膜；组织学；豚鼠

鼓膜穿孔是鼓膜的常见损伤之一，通常是由外伤、中耳炎或鼓膜置管引起[1]，不能自愈的急性或慢性鼓膜穿孔常需手术干预。目前用于鼓膜修补的材料多为自体材料，如：筋膜、脂肪组织、软骨膜及软骨-软骨膜复合体等。随着修补材料的成功应用，其在鼓膜修补术后的转归问题逐渐受到关注。有实验表明，采用筋膜成功重建的鼓膜中，筋膜的纤维层组织最终成为重建鼓膜的中层[2]；而用脂肪组织成功重建的鼓膜中，术后的组织学研究发现，外层的上皮层及内层粘膜层之间存在着大量的脂肪细胞[3]。然而，在国内，关于软骨-软骨膜复合体重建的鼓膜术后组织学结构特点及复合体转归的报道较少。本研究旨在观察以耳甲腔软骨-软骨膜复合体重建鼓膜后的组织学变化，为其临床应用提供参考。

1材料与方法

1.1实验动物及分组实验动物为雄性健康杂色豚鼠45只，体重200～250 g(购自安徽省立医院动物实验中心)。所有的动物饲养、管理及实验过程均符合国际科学技术委员会发布的《实验动物管理条例》、卫生部发布的《医学实验动物管理实施细则》和安徽医科大学实验动物伦理委员会章程。实验用豚鼠全身无明显畸形，耳廓反射正常，耳内镜下检查外耳道及鼓膜均正常。将所有豚鼠随机分为三组：A组(15只)术后观察时间为2周；B组(15只)术后观察时间为6周；C组(15只)术后观察时间为12周；A、B、C组均以左耳为实验耳，取B组5只豚鼠的右耳(5耳)为对照组。

1.2鼓膜穿孔模型制作A、B、C三组豚鼠均分别以3%戊巴比妥钠水溶液行腹腔注射(0.1 ml/100 g)麻醉后，剃除左耳周毛发，常规消毒、铺洞巾，耳后皮下注射0.5 ml 1%利多卡因溶液。距耳后沟约0.5 cm处切开皮肤，前翻术耳耳廓，切开外耳道后壁皮肤，暴露鼓膜，显微钩针以锤骨柄为中心切开鼓膜，形成1/4鼓膜面积的穿孔，并刮除锤骨柄上残余鼓膜组织；对照组同法制作右侧鼓膜穿孔模型。

1.3鼓膜穿孔修补术A、B、C组完成左鼓膜穿孔造模后，即分离皮下组织至耳甲腔根部软骨，取软骨-软骨膜复合体(以下简称复合体)移植物，并用游标卡尺(精度0.1 mm)测量复合体厚度后，将复合体置于无菌生理盐水中备用。修剪复合体至合适大小，置于锤骨柄上，复合体周围与穿孔鼓膜边缘接触良好，外耳道内放置明胶海绵块固定；浸润适量磺胺嘧啶钠；缝合切口后动物置于保温毯中麻醉复苏。

对照组完成鼓膜穿孔术后，术腔内不放置明胶海绵，仅浸润适量磺胺嘧啶钠。

1.4观察指标

1.4.1鼓膜愈合时间每日观察A、B、C及对照组鼓膜愈合状况，鼓膜愈合标准：A、B、C组以复合体与残余鼓膜间无缝隙判断为愈合；对照组以鼓膜未见明显穿孔判断为愈合。

1.4.2鼓膜修补术后复合体厚度观察及测量A、B、C三组分别于鼓膜修补术后2、6、12周处死豚鼠，取出软骨-软骨膜复合体后测量其厚度值，为减小复合体术前及术后厚度测量的误差，采用精度为0.1 mm游标卡尺测量，每块复合体厚度测量三次取平均值：第一次测量复合体的上部的厚度，第二次是测量复合体中部的厚度，第三次是测量复合体下部的厚度[4]。

1.4.3重建鼓膜的组织结构及纤维-软骨膜层的血管数量观察重建鼓膜完整取出后经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋及染色后，于显微镜下计数三组纤维-软骨膜层血管的数量：随机选取三个高倍镜视野，计数视野内的血管，取其平均值。

1.5统计学方法实验中所得的数据采集和分析均用盲法进行处理，Graphpad 5.0作图，以SPSS 16.0软件行统计学分析，组间比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1鼓膜愈合时间A、B、C三组及对照组鼓膜穿孔术后均愈合，对照组鼓膜穿孔愈合时间为7.2±0.84天，A、B、C三组鼓膜修补术后鼓膜愈合时间为3.8±0.84天，行鼓膜修补术各组的平均愈合时间较对照组明显缩短(P<0.05)。

2.2软骨-软骨膜复合体修补鼓膜穿孔前后的厚度比较鼓膜修补术前植入前A、B、C三组复合体的厚度分别为0.199±0.023、0.198±0.017、0.193±0.021 mm，三组间差异无统计学意义(P>0.05)；鼓膜修补术后2周A组复合体的厚度为0.227±0.024 mm，较术前明显增厚(P=0.001)，术后6周，B组复合体厚度较A组变薄，至12周时，C组复合体的厚度较A、B组术后复合体的厚度明显变薄(P<0.001)，且C组复合体厚度较植入前明显变薄(P<0.05)(表1)。

表1　三组鼓膜修补手术前后复合体的厚度比较±s)

注:*与本组植入前比较，P<0.001; △与A组植入后比较，P=0.016； #与A、B组植入后比较，P<0.001

2.3重建鼓膜组织学观察术后两周时可见A组植入后软骨膜和残余鼓膜的纤维层融合，成为纤维-软骨膜层，由外向内由鳞状上皮层、纤维-软骨膜层、软骨层及粘膜层构成，各层组织均肿胀，纤维-软骨膜层内大量炎症细胞浸润；到术后第6周时，B组各层结构均与A组(第2周)相同，但纤维-软骨膜层内炎症细胞浸润较A组减少，组织肿胀减轻；至第12周时，可见C组重建的鼓膜由鳞状上皮层、软骨层及粘膜层构成，纤维-软骨膜层已基本消失(图1)。

2.4复合体植入前后纤维-软骨膜层血管数量变化复合体植入前，三组软骨膜中血管数量极少，而在植入第2周(A组)后，血管数量明显增加，单位面积中血管数量达13.28±2.49个，在植入第6周(B组)后，单位面积中血管数量开始下降，为7.71±2.49个，至植入后第12周(C组)，单位面积内血管数量极小，A、B、C三组间差异均有统计学意义(P<0.01)，C组与植入前差异无统计学意义(图2)。

图1　三组重建鼓膜的组织学观察(DAB×100)

a为术后2周重建鼓膜的组织学切片，镜下可见其由上皮层、纤维-软骨膜层、软骨层及粘膜层构成；b为术后6周重建鼓膜的组织学切片，镜下可见其由上皮层、纤维-软骨膜层、软骨层及粘膜层构成；c为术后12周重建鼓膜的组织学切片，镜下可见其由上皮层、软骨层和粘膜层构成

图2　三组重建鼓膜纤维-软骨膜层的血管密度(DAB×200)

a为术后2周时重建鼓膜纤维-软骨膜层中血管的镜下图像，可见血管样组织大量增殖；b为术后6周时重建鼓膜纤维-软骨膜层中血管的镜下图像，可见血管样组织，但密度较两周时明显减低；c为术后12周时重建鼓膜镜下图像，因其已无纤维-软骨膜层，故结构中未见到明显血管样结构

3讨论

关于鼓膜修补的材料应该符合以下几个原则：首先，材料应该可靠，若为组织工程材料，应无耳毒性；另外，应该具有较高的修补成功率，若为自体移植物，则术后对取材部位无不良影响；在组织结构方面，该材料应该可以作为一种支架，供上皮层的细胞移植来封闭穿孔及血管重建；最后，重建的鼓膜应该具有与正常鼓膜相似的三层组织结构[5]。张志刚等[6]对比研究了颞肌筋膜、耳屏软骨膜及耳屏软骨-软骨膜复合体移植物在鼓膜修补术后的形态学变化及听力改变，发现耳屏软骨-软骨膜复合体修复的穿孔鼓膜愈合率达100%，但颞肌筋膜、耳屏软骨膜修复的穿孔鼓膜术后出现不同程度的内陷、粘连，部分患者出现了再次穿孔。从组织学的观点分析，可能因为重建鼓膜的鳞状上皮层和粘膜内层中间的纤维组织或脂肪细胞不具有抵抗外界压力的作用及重建鼓膜中层的纤维细胞的排列方式与正常鼓膜不同[7]；并且这些较柔软的组织本身具有易皱缩的特性[8]。

关于软骨作为重建或修补鼓膜材料的人和动物实验表明，随着时间的迁移，软骨板会发生不同程度的软化，但软骨基质仍可以保持完整；即使伴有咽鼓管功能不良，软骨仍可以保持其本身的硬度，抵抗重建鼓膜过程中的回缩及其对软骨的吸收和再穿孔[9]； 且由于软骨自身有一定的弯曲度，当其凹面面对外耳道时，其解剖特点与正常鼓膜相似；此外，由于植入前已经将其凸面的软骨膜移除，故术后软骨不会与鼓岬粘连。从本研究结果看，重建鼓膜在术后第2周和第6周由上皮层、纤维—软骨膜层、软骨层和粘膜层构成，第12周时重建完成鼓膜最终由上皮层、软骨层、粘膜层构成，重建鼓膜的纤维-软骨膜层逐渐消亡，原有鼓膜可以抵抗外界压力的纤维中层由软骨层代替，因软骨本身具有一定的硬度，不易变形，这可能就是软骨-软骨膜复合体重建鼓膜可以平衡鼓室内外压力、不易发生再穿孔的组织学原因。鼓膜修补的成功率与很多因素有关，如咽鼓管功能、局部是否感染等，故在术前应完善咽鼓管功能的检查，术中选取适合的修补材料，术后注意抗感染药物的局部及全身应用，以保证鼓膜修补的成功率。

Zahnert等[10]通过实验证明理想的修补鼓膜穿孔的软骨厚度约为0.5 mm，该厚度被认为能在足够的机械稳定性与减少声学传递衰减之间取得平衡，但该实验并未将软骨移植物与听骨链及内耳相连接，不能反映实际应用中软骨厚度对稳固性及听力的影响；杜娟等[11]研究发现临床手术中取用的人耳屏软骨-软骨膜复合体的厚度与术后听力无明显相关性。本研究显示软骨-软骨膜复合体植入后的厚度呈现出较植入前增厚-持平-变薄的变化趋势，随着时间的延长，厚度逐渐稳定；在鼓膜愈合良好、听骨链完整及活动度较佳时，移植物的厚度不同可能对听力产生影响；故临床上取用自体移植物的厚度不一定固定于0.5 mm，因为随着时间的延长，复合体的厚度会逐渐变化至一个相对稳定的数值，届时植入体的厚度才可能是影响听力的部分因素，但用于修补鼓膜穿孔的耳廓软骨-软骨膜复合体的最佳厚度及其对听力的影响尚有待进一步研究。

杜晓燕等[12]曾用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)滴注豚鼠的穿孔鼓膜后发现，bFGF可促进鼓膜的愈合，其重建的鼓膜与正常鼓膜的组织结构相似，并且可以减少瘢痕组织的生成；熊观霞等[13]用人重组表皮生长因子(rhEGF)滴注于豚鼠的穿孔鼓膜得出了类似结果。本研究结果显示重建的鼓膜经过炎症细胞的渗出、纤维组织的牵拉、血管的再生等过程，术后2周时，重建鼓膜中炎症细胞大量浸润，血管大量增殖，各层组织均较正常时肿胀；第6周时，重建鼓膜中炎症细胞及血管数量均较第2周时减少，组织肿胀减轻；到第12周时，纤维-软骨膜层已基本消失，重建鼓膜基本形成，可见术后两周为重建鼓膜愈合的关键期。是否可在软骨-软骨膜复合体修补鼓膜穿孔的术后第2周关键期加用bFGF或rhEGF促进鼓膜的愈合，并减少疤痕组织形成，值得进一步观察。

组织愈合过程中血管的新生是由于血管内皮细胞增殖与迁移，形成新血管[14]，其过程复杂，受众多正性和负性调节因子的调控。本实验结果可见修补鼓膜穿孔的植入体的血管数量呈现增殖-减少-正常的变化趋势。在鼓膜愈合的过程中，若适时加用血管生成刺激因子，可能可促进鼓膜的愈合，减少愈合不佳的几率。

综上所述，耳廓软骨-软骨膜复合体重建鼓膜的愈合时间短于鼓膜自行愈合的时间；植入后复合体的厚度较植入前呈先增厚再变薄，软骨膜层血管数量表现为先增加后减少；重建鼓膜最终组织学分层与正常鼓膜组织学结构相似。今后还应进一步了解软骨-软骨膜植入前后不同时期对听力的影响；另外，还可观察在不同时期加入促细胞或血管生成的生长因子后重建鼓膜的转归，为临床鼓膜修补材料的选择及应用提供参考。

4参考文献

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3Kwong KM, Smith MM, Coticchia JM.Fat graft myringoplasty using umbilical fat[J].International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2012,76:1098.

4Khan MM, Parab SR. Average thickness of tragal cartilage for slicing techniques in tympanoplasty[J]. The Journal of Laryngology & Otology,2015, 129:435.

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6Zhang ZG, Huang QH, Zheng YQ,et al. Three autologous substitutes for myringoplasty: a comparative study[J]. Otol Neurotol,2011,32:1234.

7Teht BM, Shen Yi, Friedland PL, et al. A review on the use of hyaluronic acid in tympanic membrane wound healing[J]. Expert Opinion on Boilogical Theropy,2012,12:23.

8Shin SH, Lee WS, Kim HN, et al. Wheel-shaped cartilage-perichondrium composite graft for the revention of retraction pocket development[J]. Acta Oto-Laryngologica, 2007,127: 25.

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10Zahnert T,Huttenbrink KB,Murbe D,et al.Experimental investigations of the use of cartilage in tympanic membrane reconstruction[J].Am J Otol,2000,21:322.

11杜鹃,许为青,赵海专.耳屏软骨-软骨膜复合体厚度的测量及其在鼓室成形术中的应用[J].听力学及言语疾病杂志,2014,22:257.

12杜晓燕.碱性成纤维细胞生长因子对慢性鼓膜穿孔愈合的影响[J].温州医学院学报,2002,32:142.

13熊观霞,雷文斌,李扬,等.人重组表皮生长因子促进鼓膜创伤愈合的动物实验研究[J].听力学及言语疾病杂志,2006,14:216.

14王兆钺.血管新生的研究进展[J].中华医学杂志, 2004,13:1137.

(2015-09-07收稿)

(本文编辑雷培香)

网络出版时间：2016-4-2615：52

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1552.002.html

The Postoperative Outcome of the Cartilage-perichondrium Complex Reconstructed Tympanic Membrane Perforation in Guinea Pig

Ding Dong， Xu Weiqing， Wang Yinfeng， Wan Guanglun

(Department of Otolaryngology-Head &Neck Surgery，the Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Hefei， 230001,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the thickness and histologic changes of cartilage-perichondrium complex(CP) and vascular density changes in perichondrium after repairing perforated eardrum.MethodsForty-five male guinea pigs were randomly divided into three groups, and were used to create left TM perforation. The left cavum conchae cartilage-perichondrium was immediately used to repair the perforation. The observation time for group A was two weeks, group B was six weeks and group C was twelve weeks. The thickness of the composite was measured before and after the implantation. The histologic changes of implants and the vascular change in perichondri were observed.ResultsThe healing time for the left ear was 3.8±0.84 , and the right ear 7.2±0.84.The thickness of the composite for group A increased by 14.4% (P<0.05). There was no significant change in the thickness of group B after implantation(P>0.05). Group C decrease by 14.2%(P<0.05). After implantation, the thickness of cartilage in group C was decreased by 34.2% compared to that in group A(P<0.05). At the 2nd week in post-implantation, the number of vessels within the unit area of fiber-perichondrium was up to 13.28±2.49, while the above number reached to 7.71±2.49 at the 6th week after implantation. The final histological structure of reconstructed tympanic membrane at the 2nd week and 6th week was composed of squamous epithelial layer, fibrous-perichondrium layer, cartilaginous layer and mucous layer. The above histological structure at 12th week was composed of squamous epithelial layer, cartilaginous layer and mucous layer. ConclusionThe healing time of the reconstructed tympanic membrane is shorter than the time spent on healing on its own. The thickness of the composite in post-implantation in three groups first increased and then decreased compared to that in pre-implantation. The number of blood vessels of fiber-perichondrium in the reconstructed tympanic membrane first increased and then reduced. The layers of final histological structure of reconstructed tympanic membrane are similar to those of normal tympanic membrane. From the perspective of histology, the cartilage-perichondrium composite is the suitable material for repairing tympanic membrane.

【Key words】Tympanic membrane perforation;Cartilage-Perichondrium;Histology;Guinea pig

【中图分类号】R764.9+2

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2016)03-0251-05

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.008

作者简介：丁栋，男，安徽人，住院医师，硕士研究生，主要研究方向为耳科学。通讯作者：许为青(Email: weiqingxu@aliyun.com)

*2013年安徽省卫生厅医学科研课题计划(13zc042)资助

1安徽医科大学附属安徽省立医院耳鼻咽喉头颈外科(合肥230001)