连翘、薄荷混合挥发油β-环糊精包合物的制备工艺研究＊

张艳军，王永香，孟 瑾，朱明岩，吴 云，萧 伟＊＊

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

连翘、薄荷混合挥发油β-环糊精包合物的制备工艺研究＊

张艳军1,2，王永香1,2，孟 瑾1,2，朱明岩1，吴 云1,2，萧 伟1,2＊＊

（1.江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2.中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

目的：本研究旨在探究β-环糊精包合连翘、薄荷混合挥发油的最佳工艺。方法：以挥发油包合率、包合物得率为综合评价指标，采用饱和水溶液法制备连翘、薄荷混合挥发油β-环糊精包合物，通过L9（34）正交实验考察了挥发油与β-环糊精的配比、包合温度及包合时间对制备工艺的影响，找出最佳的制备工艺条件并进行了放大验证。并用TLC、显微镜鉴别的方法对包合物进行了表征和分析。结果：优选出最佳制备工艺条件为：挥发油与β-环糊精的配比为1:8，包合温度为55℃，包合时间为3 h。结论：本实验为连翘、薄荷混合挥发油包合工艺获得最佳工艺参数及产业化放大提供了试验依据。

连翘 薄荷 挥发油 包合工艺

连翘、薄荷是临床上常用的中药材，许多已上市治疗感冒的中药成方制剂（颗粒、片剂等）均含有此两味药材。连翘属木犀科植物Forsythia supensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，连翘药材中挥发油是其发挥药理 活性的重要组成成分[1]，具有清热解毒、消肿散结、抗菌抗病毒等功效，用于痈疽、瘰疬、乳痈、丹毒温病初起等疾病治 疗[2]。薄荷Mentha hapiocalyxBriq为唇形科薄荷脑Mentha L.多年生宿根草本植物，全草可入药，其有效成分为薄荷挥发油，薄荷油是由薄荷茎、叶经水蒸气蒸馏以及部分脱脑加工所制得，味辛，性温，无毒，具有较强的提神、抑菌、祛风等药理作用[3,4]。挥发油类成分 不稳定，在制剂成型工艺过程中直接加入易挥发，影响药物的疗效。β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）作为一种包合剂广泛应用于挥发油包合物的制备，便于制成合适的剂型，可以减少生产、贮存过程中的挥发或氧化变质，能够有效的提高制剂的稳定性和疗效性[5-8]。目前有关连翘挥发油与薄荷挥发油的β-CD单独包合工艺研究已有报道[9-12]，但有关连翘、薄荷混合挥发油包合 工艺的研究未见报道。

银翘败毒片是本公司在研品种项目之一，该处方含有连翘、薄荷、金银花、板蓝根、升麻等9味药材，是一种用于治疗风热型感冒的临床经验方，本文作者在进行银翘败毒片制剂工艺的研究中，采用水蒸气蒸馏法提取连翘、薄荷混合挥发油，使用饱和水溶液方法制备了连翘薄荷混合挥发油β-CD包合物，通过正交实验法优化了包合工艺，确定了制备包合物的最佳工艺参数，并且对包合物进行了薄层色谱 鉴别和显微影像的鉴定，为产业化生产提供了理论实验依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

SHZ-Ⅲ型循环水式多用真空泵（保定高新区阳光科教仪器厂），KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海黄海药检仪器有限公司），EMS-9F加热磁力搅拌器（天津市欧诺仪器表有限公司）；101-2型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），显微镜（中国南京江南光学仪器厂），ZTQ3E多能提取罐（常熟市医药化工设备总厂）。

1.2 药物与试剂

连翘（浙江宁波药材股份有限公司），经江苏康缘药业股份有限公司执业药师吴舟鉴定为木犀科植物F. suspense（Thunb.）Vahl 的果实；薄荷（湖北金贵中药饮片有限公司），经江苏康缘药业股份有限公司执业药师吴舟鉴定为唇形科薄荷属薄荷；连翘、薄荷混合挥发油（江苏康缘药业股份有限公司，批号120601）；β-CD，分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）。其余所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 挥发油的制备

取连翘90 kg，薄荷54 kg，润湿、切断，投入多能提取罐中，加入10倍量纯化水，夹层蒸汽加热，药液温度控制在100±5℃，压力控制在0.2 MPa以内，回流提取3小时，得连翘薄荷油2 475 mL，连翘薄荷油得率为1.72%。连翘、薄荷油置于4℃中贮存，备用。

2.2 挥发油包合工艺的研究

2.2.1 连翘、薄荷混合挥发油β-CD包合物的制备

取挥发油8倍量的β-CD，加入一定量水中，升温至60℃制成饱和水溶液，在100 r·min-1搅拌下缓缓滴加挥发油，加完挥发油后60℃保温搅拌3 h；4℃冷藏12 h，过滤，用石油醚（60-90℃）对包合物进行洗涤[13]，除去表面未包合的 挥发油，室 温干燥，研碎。即得白色粉末状包合物，备用。

2.2.2 包合效果评价指标

称取一定量的包合物细粉，置500 mL烧瓶中，加入蒸馏水300 mL，连接挥发油提取器，按2010年版《中国药典》（一部）附录挥发油测定法项下甲法[14]，测得包合物实际含油量。同时精密量取混合挥发油1 mL，同法操作，计算空白回收率。

挥发油空白回收率（%）＝收集挥发油量（g）/加入挥发油量（mL）×100%

包合物得率（%）=包合物质量/（β-CD投入量+挥发油投入量）×100%

挥发油包合率（%）=包合物实际收油量/（挥发油的投入量×空白回收率）×100%

综合评分=挥发油包合率×70%+包合物得率×30%

2.2.3 单因素考察

2.2.3.1 包合物制备的单因素考察指标

在包合物的单因素考察实验中，主要以连翘、薄荷混合挥发油与β-CD的配比、包合的温度及包合时间为指标，考察各主要因素对包合物的影响，并以此指标进行正交试验筛选出最佳工艺条件。

2.2.3.2 连翘、薄荷混合挥发油与β-CD的配比因素

按挥发油:β-CD为1:4，1:6，1:8，1:10 和1:15的比例投料，按“2.2.1”项下包合物制备方法，在60℃恒温水浴中，搅拌3 h，制备包合物，产物干燥。量取适量的产物，按“2.2.2”项下的方法测定包合物中挥发油的包合率，结果如下表1所示。

表1 连翘、薄荷混合挥发油与β-CD配比因素的影响

结果说明，包合物按挥发油:β-CD在1:6 到1:10范围内制备时，所得的挥发油包合率相对较高且稳定，比例过高不利于包合率的提高。结果分析，可能是当加入混合挥发油量太少时，油挥发对其包合有影响，使产率降低。

2.2.3.3 包合温度因素

按挥发油:β-CD为1:8比例投料，按“2.2.1”项下包合物制备方法，在一系列不同温度下，搅拌3 h，制备包合物，干燥。分别取产物适量，按“2.2.2”项下的方法测定包合物中挥发油的包合率，结果如下表2所示。

表2 包合物温度因素的影响

结果表明，在55、60、65℃下制备的包合物产率相对较高，温度过高不利包合率的提升。结果分析，温度过高可能加剧混合物挥发油的挥发，不利于包合物的制备；温度过低不利于环糊精饱和水溶液的形成，从而影响包合工艺。

2.2.3.4 包合时间因素

按挥发油:β-环糊精为1:8的比例，按“2.2.1”项下包合物制备方法，在60℃时按下表各搅拌时间下制备包合物，按“2.2.2”项下的方法测定包合物中挥发油的包合率，结果如下表3所示。

由表测定结果可知，1-3 h内包合率相对稳定，延长包合时间包合率反而降低。因此，增加搅拌时间不利于包合物的制备。结果分析，搅拌时间太长，包合率降低，可能是由于薄荷油受热时间过长而挥发损失。

表3 包合时间因素的影响

表4 包合工艺的考察因素和水平表

表5 L9（34）正交表及试验结果

表6 方差分析表

2.2.4 正交试验及结果

根据预实验结果，选择连翘、薄荷混合挥发油与β-CD的配比，包合温度，及包合的时间3项考察因素，各取3个水平进行L9（34）正交实验，因素水平见表4，并以包合物得率和挥发油包合率为综合考察指标，筛选出最佳的工艺条件，结果见表5、表6。

由实验结果进行直观分析可知，各因素对试验结果影响由大到小依次为：A＞C＞B，最佳工艺条件为A2B2C3。因素A、C各水平间具有较显著性的差异，对挥发油包合有相对显著性影响，B因素对挥发油包合工艺的影响不显著。考虑到实际生产中成本因素，包合温度确定为55℃。因此，连翘、薄荷混合挥发油β-环糊精包合物最佳的包合工艺为A2B1C3，即挥发油:β-CD的配比为1:8，包合温度为55℃，包合时间为3 h。

2.2.6 验证试验

为验证方案A2B1C3的合理性，按照方案A2B2C3的工艺条件重复3次实验，所得包合物的综合评分为82.58%、85.43%、84.91%，表明所确定的最佳工艺A2B1C3合理。

2.3 包合物的鉴别

2.3.1 包合物TLC实验

为了制备得到较为纯净的包合物，本实验用石油醚（60-90℃）对包合物表面未包合的挥发油进行洗涤，通过TLC对包合物包合前后以及淋洗前后进行鉴别。具体方法如下：

未用石油醚洗涤的包合物作为样品1；β-CD的水溶液作为样品2；连翘薄荷油的乙醇溶液作为样品3；取过量淋洗后的包合物，加水超声溶解20 min，取上清液作为样品4；包合物（洗涤）中提取挥发油的乙醇溶液作为样品5。分别取上述5种样品液2 μL，按从左到右的顺序滴加于同一硅胶G板上，以石油醚（60-90℃）与乙酸乙酯（17:3）为展开剂，上行展开12 cm，取出、晾干，喷以5%香草醛-硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰可见。结果如图1所示，样品2和样品4无斑点，说明连翘薄荷油β-CD包合物制备完成；样品3和样品5在相同位置上有相同颜色的斑点，说明包合过程未改变连翘薄荷油的化学成分；样品1有斑点，说明尚有挥发油未被包合，即包合物在洗涤之前表面有挥发油存在；样品4无斑点，说明连翘薄荷油β-CD包合物表面的挥发油已淋洗干净且包合成功。

2.3.2 显微镜鉴别

将β-CD、挥发油与β-CD的混合物、挥发油-β-CD包合物用水溶解后用胶头滴管吸取少量溶液滴到载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜观察其成像结果（图2）。

图1 连翘、薄荷混合挥发油包合物TLC层析图

图2 挥发油β-CD包合物的显微成像（10×10）

由图2显微镜成像观察得，β-CD的形状为半透明板状结晶；而混合物挥发油吸附于β-CD的表面，粘成一团；挥发油与β-CD形成的包合物则为细碎晶粒，呈不透明、相对分散的微细晶粒，没有明显的板块状结晶或油状物。在形成的包合物中，原来的β-CD半透明柱状体晶体被挥发油充填，说明包合成功[15]。

2.4 稳定性试验

将连翘、薄荷混合油β-CD包合物用于银翘败毒片制剂工艺中，与传统的喷洒工艺制备（制备方法：将挥发油喷洒到干粉上，加入淀粉、蔗糖、硬脂酸镁和微晶纤维素，混匀，干法制粒，压片，包衣，分装）的样品进行稳定性对比，所制样品放在常温常压密闭容器内，避光保存，间隔0、1、2、3月后测定挥发油的含量，结果见表7。

3 讨论

运用β-CD对连翘、薄荷混合挥发油进行包合，可以有效的提高挥发油的稳定性，而且使液体油变为固体粉末，便于制剂的成型，对工业生产具有较大的意义。本文采用饱和水溶液制备得到连翘、薄荷混合挥发油β-CD包合物，以混合挥发油的包合得率和挥发油的包合率为综合考察指标，对制备工艺中的几个主要因素进行了探讨，结果表明挥发油:β-CD的配比影响因素最大；正交试验结果表明β-CD包合连翘、薄荷挥发油的最佳工艺条件为，挥发油:β-CD的配比为1:8、包合温度为55℃、搅拌的时间为3 h。本试验结果为连翘、薄荷挥发油包合工艺在制剂成型工艺的应用提供了一定的依据。

该方法简单、易行，操作方便，适合工业化生产。将所制备的包合物用于银翘败毒片制剂工艺中，与传统的喷洒工艺制备的样品进行稳定性实验对比，结果表明，β-CD包合样品的挥发油稳定性远远大于传统制备方法，能够有效的提高制剂的质量，保证了药物的临床疗效。

表7 稳定性试验对比/%

1 孔杰,姚健,达文燕,等.连翘挥发油化学成分的研究.西北师范大学学报(自然科学版), 2001, 37(4): 77-80.

2 肖会敏,王四旺,王剑波,等.连翘挥发油的成分分析及其药理作用的研究进展.时珍国医国药, 2008, 19(8): 2047-2049.

3 徐国钧.生药学(第2版).北京:人民卫生出版社, 1996: 290-291.

4 岳红坤,常明,张东红,等.薄荷油β-环糊精包合物的制备工艺优化和产品表征.井冈山大学学报(自然科学版), 2011, 32(5): 40-45.

5 周利国,魏凤玲.环糊精饱和技术及应用.医学创新研究, 2006, 3(6): 31-33.

6 张孝法,曹光环,王正宽,等.七味通痹口服液挥发油的羟丙基-β-环糊精包合工艺研究.世界科学技术-中医药现代化, 2010, 12(2): 304-306.

7 藤赣峰,吴坤生.山腊梅挥发油β-环糊精包合的制备工艺研究.世界科学技术-中医药现代化, 2002, 12(2): 58-59.

8 王正宽,王振中,徐连明,等.胶体磨法包合丹皮酚及包合物稳定性考察.世界科学技术-中医药现代化, 2010, 12(2): 307-310.

9 王守愚,徐淑卿,史公良. β-环糊精包合连翘挥发油的工艺研究.中成药, 2006, 28(6): 908-910.

10 覃柳娟,莫少红,陈晓军.薄荷油β-环糊精包合物的制备研究.时珍国医国药, 2003, 14(6): 348-349.

11 张幸生.薄荷油β-环糊精包合物的制备工艺研究.时珍国医国药, 2003, 16(12): 1270-1271.

12 王七根,谢碧海,黄慧烽.连翘挥发油β-环糊精包合物制备工艺的研究.时珍国医国药, 2003, 17(5): 56-57.

13 桂卉,刘东文,颜红,等.白术、木香混合挥发油β-CD包合物的制备与鉴定.中成药, 2009, 31(9): 863-865.

14 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版一部).北京:中国医药科技出版社, 2010: 附录63,124.

15 宋凤兰,金海杰,潘育方,等.白纸扇感冒颗粒中挥发油β-环糊精包合物的制备.中国实验方剂学杂志, 2012, 18(23): 9-11.

Preparation of Forsythia and Mentha Volatile Oil-β-cyclodextrin Inclusion Compound

Zhang Yanjun1,2, Wang Yongxiang1,2, Meng Jin1,2, Zhu Mingyan1, Wu Yun1,2, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study aimed to explore the optimum conditions for the preparation of forsythia and mentha volatile oil-β-cyclodextrin inclusion compound. With inclusion rate of volatile oil and yield of inclusion complex as indexes, saturated aqueous solution method was selected to perpetrate the forsythia and mentha volatile oil-βcyclodextrin inclusion compound. By means of L9(34) orthogonal experiment, three factors including the proportion of oil and β-cyclodextrin, temperature and inclusion time were studied to determine the optimum conditions. This prepared inclusion complex was testified by analyses of microscopic imaging and thin layer chromatography (TLC). It was found that the optimum conditions for inclusion were as follows: the proportion of oil and β-cyclodextrin was 1:8, while temperature was 55℃, and inclusion time was 3 h. In conclusion, this study provided the feasible and theoretical experiment basis for the optimal inclusion technology of forsythia and mentha volatile oil-βcyclodextrin inclusion compound and industrialization amplification.

Forsythia, menthe, volatile oil, inclusion process

10.11842/wst.2016.03.033

R283

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷）

2014-11-20

修回日期：2014-12-19

＊ 科学技术部“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，研究员级高级工程师，博士，主要研究方向：中药新药的研究与开发。