基于多成分含量测定的六味地黄浓缩丸溶出度考察＊

石 伟，倪付勇，李 云，张 晖，孙仙玲，黄道省，李家春,王振中，萧 伟＊＊

（1. 南京中医药大学药学院 南京 210000；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001；3. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001）

基于多成分含量测定的六味地黄浓缩丸溶出度考察＊

石 伟1,2，倪付勇2,3，李 云1,2，张 晖2,3，孙仙玲1,2，黄道省2,3，李家春2,3,王振中2,3，萧 伟2,3＊＊

（1. 南京中医药大学药学院 南京 210000；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001；3. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001）

目的：本研究以没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷5个成分的含量为溶出指标，建立多成分指标评价六味地黄浓缩丸溶出度的方法。方法：测定条件为浆法，以900 mL 0.1 mol·L-1盐酸作为溶出介质，转速100 r·min-1，温度（37.0±0.5）℃。采用RP-HPLC外标法定量，Agilent TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02%三氟乙酸溶液为流动相，梯度洗脱；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长：238 nm。结果：该厂家10个批次的六味地黄浓缩丸中5个成分的溶出曲线相似因子ƒ2大部分高于50，表明该厂家不同批次间六味地黄浓缩丸的溶出度差异性较小。结论：该方法简便，重复性良好，适用于六味地黄浓缩丸中5个成分的溶出度测定。

六味地黄浓缩丸高效液相色谱法溶出度多成分5-羟甲基糠醛

药物的溶出度是指药物从丸剂、片剂等固体制剂在规定溶出介质中溶出的速度和程度。因此，考察固体制剂的溶出度可以间接反映该制剂的内在质量[1-8]。六味地黄浓缩丸是由酒萸肉（制）、熟地黄、茯苓、牡丹皮、泽泻、山药6味药材经一定工艺流程制备所得的复方制剂[9]，用于治疗腰膝酸软、肾阴亏虚等[10-15]。2010版《中国药典》对六味地黄浓缩丸中的马钱苷、丹皮酚进行控制[9]，相较其成分的复杂性，不足以反映该制剂的内在品质。本研究以没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷5个有效成分的含量为溶出指标[16-18]，测定同一厂家10批样品的溶出度，以考察其质量。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XP6电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；BP211D型电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；ZRS-8G智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）。

没食子酸，纯度90.1%（中国食品药品检定研究院，批号：110831-200803）；5-羟甲基糠醛（中国食品药品检定研究院，批号：110626-201308）；马钱苷对照品，纯度99.2%（中国食品药品检定研究院，批号：110640-201005）；芍药苷，纯度94.9%（中国食品药品检定研究院，批号：110736-201136）。莫诺苷由军事医学科学院从山茱萸药材中分离得到，经1H-NMR，13C-NMR进行结构鉴定，HPLC峰面积归一化法分析测得纯度为95.7%。乙腈（色谱纯），水为自制纯化水，其余均为分析纯。10批六味地黄浓缩丸均购自厂家A（批号1-10）：130505、130920、131237、140147、140239、140335、140341、140522、140530、140616。

图1 高效液相色谱图

图2 对照品结构式

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为：乙腈（A）-0.02%三氟乙酸（B），梯度洗脱（0-5 min，96% B；5-30 min，96% B-84% B；30-40 min，84% B）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30℃；检测波长：238 nm。色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸（Ⅰ）、5-羟甲基糠醛（Ⅱ）、莫诺苷（Ⅲ）、马钱苷（Ⅳ）、芍药苷（Ⅴ）对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加甲醇分别制成每1 mL含没食子酸0.378 μg、5-羟甲基糠醛（5-HMF）1.89 μg、莫诺苷0.212 μg、马钱苷0.346 μg、芍药苷0.229 μg的混合对照品溶液，结构式图见图2。

2.3 供试品溶液的制备

取重量差异下的浓缩丸样品，精密称定。参照《中国药典》（2010版二部）附录XC溶出度测定法第二法，溶出介质为900 mL，经脱气处理后的0.1 mol·L-1的盐酸，采用浆法，转速100 r·min-1，温度（37.0±0.5）℃，于10、20、30、45、60、90、120 min分别取样2 mL（取后补同温溶出介质等量），经0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品混标溶液20 μL，按“2.1”色谱条件，进样，测定，连续6次。以没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷的峰面积计算，RSD分别为0.57%、1.10%、0.94%、0.71%、1.20%，结果表明，仪器精密度良好。

2.5 线性关系考察

取没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成所需浓度的对照品溶液，即得。分别吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积平均值为纵坐标（Y），对照品浓度（μg·mL-1）为横坐标（X），绘制标准曲线得回归方程，详见表1。结果表明，没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷在各自的浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.6 稳定性试验

精密吸取溶出时间为20 min的六味地黄溶出液液，分别于0、2、6、8、10、12、24 h进样，按“2.1”项色谱条件测定，以没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷峰面积计算，结果RSD分别为1.20%、1.40%、1.00%、0.92%、1.60%，结果表明供试品溶液放置24 h稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取同一批已知含量样品（批号：130920）粉末0.5 g，共6份，精密称定，分别精密加入没食子酸、5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷对照品适量；摇匀，取20 μL进样，测定5个成分的峰面积，计算平均回收率。详见表2。

表1 5种成分的线性范围、回归方程和相关系数

表2 回收率实验结果（n=6）

2.8 同一厂家不同批次六味地黄浓缩丸溶出度的测定

取不同批号的六味地黄丸，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液，每次进样量20 μL。取“2.2”项下的对照品溶液，进样20 μL。按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，测定5个成分的含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图3。

结合各成分实际溶出情况，本实验选择了具有较稳定和较高溶出率的批号3样品作为参比制剂，采用相似因子法（ƒ2）比较该厂家各批次产品中5个成分溶出度的差异。

计算公式为：

公式中Rt和Tt为各取样点参比和供试制剂的平均溶出率，n为取样点个数。当ƒ2值介于50到100之间时，供试制剂的溶出曲线与参比试剂相似性良好，比值越高，相似度越高。分析结果见表3。

结果显示，10批产品之间5-羟甲基糠醛、马钱苷的溶出，各批次与参比制剂间的ƒ2值均大于50；对于没食子酸的溶出，除第9批与参比制剂间的ƒ2值略低，其余均大于50；莫诺苷的溶出第6、8批与参比制剂间的ƒ2值小于50；而芍药苷的溶出，各批次相较参比制剂间的溶出度差别均较大。结果表明，该厂家所选批次之间这5个成分的溶出除芍药苷外考察基本无显著差异，佐证了该厂家的产品稳定性较好。

3 讨论

近年来，化药中的许多固体制剂比如片剂、胶囊剂等均制定了比较完整的溶出度考察项。中药溶出度的考察受限于其复杂的成分，很多固体制剂尚无溶出度考察项。目前，针对六味地黄浓缩丸，在溶出度考察方面，已发表文献多集中于一两个指标[19-22]。本实验采用HPLC法，选取了没食子酸等5个成分的含量作为测定指标，符合中药现代化和国际化的质量控制要求。

图3 10批六味地黄浓缩丸5种成分累积溶出曲线

本研究参考相关文献[23]，对水和0.1 mol·L-1的盐酸两种溶出介质进行了考察，结果与该文献报道基本一致，故选择0.1 mol·L-1的盐酸作为溶出介质。

通过采用二极管阵列检测器在210 nm至400 nm范围内扫描，结果显示，选取238 nm作为检测波长，能够很好的兼顾样品中这5种成分的紫外吸收。

六味地黄丸主要功用为滋阴补肾，王喜军[24]等通过研究六味地黄丸及血中移行成分对氢化可的松致大鼠肾虚动物模型的保护作用，初步证实分离得到的六味地黄丸血中移行成分为六味地黄丸补肾的药效物质基础，其中马钱苷和莫诺苷是补肾的核心成分。中医认为肾和内分泌腺有着密切的关系，朱东亮等[25]通过成分与药效的关联性分析，发现5-羟甲基糠醛、马钱苷等对内分泌综合效应具有正效应。戴冰等[26]采用HPLC法对阴虚证与六味地黄入血成分芍药苷浓度进行了探讨，发现阴虚证大鼠血清中芍药苷含量较健康大鼠高。没食子酸同时存在于山茱萸和牡丹皮中，测定其含量有利于两种药材的质量控制，故选择上述5个成分的含量作为溶出指标。

本实验对同一厂家10个批次的样品进行溶出度考察，由批号可知，各样本批号周期为一年，时间选择上亦具有一定的代表性；同时，含测结果显示，所选指标之一5-羟甲基糠醛的含量较高，可以降低溶出度测定中由于溶出介质体积大（900 mL），开始时溶出量较少，药液浓度偏低，峰面积较小，积分不准所带来的误差。

表3 10批样品5种成分f2值

本研究以样品中5个成分的含量变化对其进行溶出度考察，并通过相似因子法评价溶出度差异，结果显示，该厂家各批次之间4个成分（除芍药苷外）的溶出考察结果基本无显著性差异。马钱苷相似性较其他成分好，可能与其为药典含量测定指标[9]，要求较其他成分高有关。芍药苷的溶出变化存在较显著差异，其原因可能是由于该制剂中芍药苷峰面积较小，积分误差所致；也可能与原料药的差别、提取温度的不同以及提取时间的长短等因素有关。

六味地黄方成分复杂，制剂种类多样。目前，所发表的文献[19-23]多集中于测定浓缩丸的溶出度，针对其他剂型，如硬胶囊、片剂等剂型考察较少，下一步将考虑对其他剂型进行溶出度方面的研究。

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Determination of Dissolution of Liuwei Dihuang Concentrated Pills Based on Multi-Index Components

Shi Wei1,2, Ni Fuyong2,3, Li Yun1,2, Zhang Hui2,3, Sun Xianling1,2, Huang Daosheng2,3, Li Jiachun2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei2,3
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China; 3. Jangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China)

This study aimed to establish a dissolution determination method for multi-index components inLiuwei Dihuangconcentrated pills with the content of gallic acid, 5-hydroxymethyl furfural, morroniside, loganin and paeoniflorin as indexes. The paddle method was adopted with 900 mL of 0.1 mol·L-1hydrochloric acid as the dissolution medium at a rotation rate of 100 r·min-1and the temperature of 37.0±0.5℃. Adopting RP-HPLC method (an external standard method) was applied for quantitative, while Agilent TC-C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) column was with acetonitrile-0.02% TFA as mobile phase gradient elution volume flow of 1.0 mL·min-1, column temperature at 30℃, and detection wavelength at 238 nm. It was found that similarity factorsf2of the dissolution curve of the five main components of different batches ofLiuwei Dihuangconcentrated pills were mostly higher than 50, which referred to the dissolution of a smaller difference between these samples. It was demonstrated that this method was simple, reproducible, applicable for measuring the five components dissolution of Liuwei Dihuang concentrated pills.

Liuwei Dihuangconcentrated pills, HPLC, dissolution, multi-component, 5-hydroxymethyl furfural

10.11842/wst.2016.03.034

R284

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷）

2014-11-24

修回日期：2015-01-29

＊ 国家科技部“重大新药创制“科技重大专项（2013ZX09402203）：现代中药创新集群与数字制药技术平台，负责人：王振中。

＊＊ 通讯作者：萧伟，本刊编委，博士生导师，研究员，主要研究方向：中药新剂型的研究与开发。