含丹酚酸的丹参酮微乳处方工艺研究＊

蒋俏丽，刘乐环，黄瑞雪，茅玉炜，黎翊君，翟文文，戴俊东

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

含丹酚酸的丹参酮微乳处方工艺研究＊

蒋俏丽，刘乐环，黄瑞雪，茅玉炜，黎翊君，翟文文，戴俊东＊＊

（北京中医药大学中药学院 北京 100102）

目的：制备丹参多组分复合微乳，优选最佳处方及制备工艺。方法：结合伪三元相图法与单纯形网格法，以微乳粒径、包封率和载药量为评价指标，通过 Design Expert 8.06 软件进行试验设计和模型构建，响应面数据分析优化和验证最佳处方。结果：最终优选出的微乳处方为肉豆蔻酸异丙酯:15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯（solutrol-HS 15）-二乙二醇单乙基醚（transcutol P）（4:1）:纯化水为13.3:31.7:55.0，此时微乳粒径为12.88±0.57 nm，丹参酮IIA包封率为98.00±2.26%，丹参酮IIA和丹酚酸B的载药量分别为5.30±0.03、2.43±0.01 mg·g-1。结论：该法制得的微乳中丹参酮IIA包封率及载药量均较高，粒径较小，为丹参微乳制剂的开发与应用提供科学依据。

丹参总酚酸 总丹参酮 单纯形网格法 微乳 处方优化 含量测定

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，性味苦，微寒。归心、肝经。有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效[1]。现代药理学研究证明丹参对多种疾病如心血管系统疾病、消化系统疾病、中枢神经系统疾病等都具有良好的治疗效果及预防作用。丹参的药效成分主要是以丹参酮类（丹参酮IIA、隐丹参酮、丹参酮I等）为主的脂溶性成分和以酚酸类（丹酚酸A、B、丹参素、原儿茶醛等）为主的水溶性成分。目前临床上常用的丹参类口服制剂中丹参酮IIA的水溶性差，吸收时又受到P-糖蛋白外排转运的影响，绝对生物利用度低于3.5%[2,3]；丹酚酸B口服时受肠道酶水解、pH、p糖蛋白和载体转运等因素影响，绝对生物利用度也仅为2.3%[4-6]。注射制剂多以一类成分为主，难以同时包含脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类成分，患者用药的顺应性也较差。因此，本研究通过将丹参酮与丹酚酸制备成微乳，以期通过透皮给药技术使两类成分能同时起效，生物利用度得到提高，患者顺应性得到改善。

微乳是由水相、油相、表面活性剂和助表面活性剂在适当的比例下自发形成的一种透明或者半透明、低黏度、各向同性的热力学稳定体系，粒径通常在5-100 nm之间[7]。水溶性微乳能够显著增加脂溶性丹参酮类成分的溶解度，提高其生物利用度；又能够溶解丹酚酸类水溶性成分，实现两类活性成分的同时给药，发挥其协同作用。本文采用 单纯形网格法[8]（ Simplex Lattice Design，SLD）优化设计丹参复合微乳给药系统，阐明影响该制剂处方的关键因素，筛选得出最优处方。

1 材料

高效液相色谱仪（SPD-20A，日本岛津）；电子天平[BT125D，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；多点加热磁力搅拌器（RT10 PowerIKAWERKE，上海大迈仪器有限公司）；动态光散射粒径仪（NANO-ZS型，英国马尔文）。

丹参酮IIA对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110766-200619）；丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111562-201212）；丹参总酮（ 南京泽朗医药科技有限公司，批号：141011，纯度60%）；丹参总酚酸（南京泽朗医药科技有限公司，批号：141008，纯度60%）；肉豆蔻酸异丙酯（Isopropyl myristate，IPM，国药集团化学试剂有限公司，批号：20140522）； 聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯（北京凤礼精求商贸有限责任公司，批号：34445116KO）；二乙二醇单乙基醚 （ 法国Gattefossé公司，批号：146063）；乙腈、甲醇（色谱醇，美国Fisher公司），水为纯化水，其它试剂均为分析纯。

2 方法

根据文献[9-11]和预实验选择对丹参酮溶解度大，安全无刺激性的IPM为微乳油相，15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯为表面活性剂，二乙二醇单乙基醚为助表面活性剂，纯化水为水相。

2.1 伪三元相图的绘制及微乳的制备方法

伪三元相图的绘制[12-15]：将表面活性剂，助表面活性剂以特定比例（1:1、2:1、3:1、4:1、5:1）混合后与特定比例油相（油相与Smix的重量比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1）于磁力搅拌器上在300 r·min-1、38℃条件下混合均匀，将水相逐滴加入油相中，边加边搅拌，记录体系由澄清变浑浊及由浑浊再变澄清的加入水量，以油相、水相、表面活性剂-助表面活性剂混合相为3个顶点，绘制伪三元相图，结果见图1。

图1 伪三元相图

微乳的制备：将过量的丹参酮分别加入油相及混合表面活性剂中，离心取上清液，按微乳处方比例将油相与混合表面活性剂置于磁力搅拌器上在300 r·min-1、38℃条件下混合均匀。将过量的丹酚酸溶于纯化水中离心取上清作为水相，按处方比例将水相逐滴加入上述混合油相中，边加边搅拌使其形成澄清透明的含丹酚酸的丹参酮微乳。

2.2 丹参酮 II A与丹酚酸B的含量测定

液相色谱条件：色谱柱：Kromasil C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0-20 min，10-45:90-55；20-21 min，45-80:55-20；21-37 min，80:20；37-38 min，80-10:20-90，38-43 min，10:90），流速：1.2 mL·min-1，检测波长：270 nm（TSN），286 nm（Sal B）进样量：10uL 。在该色谱条件下，各成分分离度良好，结果见图2。丹参酮II A和丹酚酸B的分离度分别为1.96和3.31，理论板数分别为138 123和114 068，均符合要求。

表1 单纯形网格设计处方优化试验安排及结果

图2 模型拟合及优化范围点

2.3 SLD设计优化丹参多组分复合微乳

参照伪三元相图得到的微乳区域，同时考虑表面活性剂和油相的用量，初步选出各项的比例范围为油相：5%-15%，表面活性剂相：30%-40%，水相55%-65%。由于丹酚酸是水溶性成分，微乳中丹酚酸直接溶于水相中，因此微乳中丹酚酸的含量主要取决于水相的比例，水相比例越高，丹酚酸含量越高。故在优化处方时只以各相特定的比例为考察因素，以微乳的平均粒径、丹参酮IIA的包封率和载药量为评价指标。

3 结果与分析

3.1 伪三元相图的绘制

以上伪三元相图的结果显示，当Sm=4:1时，微乳区域最大，故选择4:1作为表面活性剂与助表面活性剂的比例。

3.2 含量测定方法学考察

方法学考察结果证明专属性良好，以峰面积积分值对对照品的进样量进行线性回归，得Sal B回归方程：Y=11 460 782.86X-89 474.00（线性范围：10.0-210.0 μg·mL-1，r=0.999 7）；TSN回归方程：Y=47 906 766.22X+4 137.54（线性范围：0.3-64.0 μg·ml-1，r=0.999 9）。方法精密度、稳定性、重复性、加样回收率RSD均小于2%，符合要求。表明此HPLC方法同时检验两种成分的准确性符合要求。

3.3 SLD设计优化丹酚酸-丹参酮复合微乳

采用 Design Expert 8.06软件中单纯形网格设计对丹参复合微乳的处方组成进行实验安排，并进行相关评价指标检测，试验设计和测定结果见表1，模型拟合及优化范围见图2。

3.3.1 模型拟合及分析

应运Design Expert 8.06软件，以油相（A）、混合表面活性剂（B）、水相（C）为自变量，平均粒径（Y1）、丹参酮II A包封率（Y2）、丹参酮IIA载药量（Y3）为评价指标进行多元回归模型拟合及优化，相应结果见表1。得到以下相应响应方程：

Y1=0.858 07A-0.079 164B+0.059 973C（R2Adj= 0.869 8，P＜0.000 1，P失拟相=0.195 5）

Y2=1.707 95A+0.158 15B+1.265 46C（R2Adj= 0.801 6，P＜0.000 1，P失拟相=0.301 0）

Y3=0.597 59A+0.098 815B-6.652 78×10-5C-7.587 82×10-3AB-4.049 69×10-3AC+3.423 73× 10-6BC（R2Adj=0.982 1，P＜0.000 1，P失拟相=0.986 4）

由Y1、Y2、Y33个方程可知：响应模型方程的P值均是＜0.000 1，远小于0.05，表明响应回归模型达到极显著水平；响应模型失拟项的P值分别为0.195 5、0.301 0、0.986 4，均大于0.05，即相对于纯误差不显著，因此3项指标的回归模型拟合非常成功。由方程Y1可以看出，对丹参复合微乳粒径影响较大的因素是油相的比例，油相的比例减少，粒径将减小；由方程Y2可以看出对丹参复合微乳中丹参酮II A包封率影响较大的因素是油相和水相的比例，随着油相和水相比例的增加，丹参酮II A包封率将增加；由方程Y3可以看出对丹参复合微乳中丹参酮II A载药量影响较大的因素是油相和混合表面活性剂的比例，随着油相和混合表面活性剂比例的增加，丹参酮II A包封率将增加。

3.3.2 最优处方的确定

Design Expert 8.06软件中单纯形网格设计时，考虑到本研究中影响载药微乳质量的主要为药物的包封率和微乳的载药量，粒径均符合要求且较小，故以微乳包封率和载药量为主要权重因子，粒径相对为次要权重因子，即包封率和载药量的重要度为四星，粒径的重要度为三星。最终得到两个理论较优处方：处方1最优评分为0.680，处方2最优评分为0.679，具体情况见图3。两个处方比例及预测值见表2。

图3 理论处方1（A）和理论处方2（B）评分图

按照以上两个理论处方各制备3批次丹参复合微乳，其平均粒径、TSN包封率和载药量见表3。

由表3可以看出，优化处方1和优化处方2的包封率和载药量的偏差的绝对值均小于10%，而处方1粒径偏差的绝对值大于10%，说明优化处方2更加符合拟合方程，且本实验拟合方程可以较好的描述因素与指标的关系，优化处方2具体优化结果见图4。

3 讨论与小结

本研究最终得到的优化处方为油相：13.327%，表面活性剂相：31.673%，水相：55.000%。

丹参酮II A和丹酚酸B在丹参药材中含量比例较高且具有明确的药理作用，因此选择丹参酮II A和丹酚酸B作为丹参多组分复合微乳制剂含量测定的指标性成分。本实验研究发现丹酚酸的载药量只与水相含量有关，丹酚酸的加入对复合微乳的粒径及丹参酮II A的包封率和载药量无明显影响。

表2 两个优化处方比例及模型拟合预测值

表3 最优处方实验实测值与预测值的比较

图4 理论处方2比例及预测值

助表面活性剂能改变表面活性剂的表面活性及亲水亲油平衡值，微乳制剂中常用无水乙醇为助表面活性剂[16]，存在容易挥发和刺激性强的缺点。本研究中选用的助表面活性剂二乙二 醇单乙基醚是近年来新合成的药用辅料，是许多活性药物如硝酸甘油、荷尔蒙等的良好溶剂，可用于局部给药、透皮给药及口服制剂的制备，是良好的吸收促进剂。毒理学研究证实其对眼部粘膜、皮肤等均无刺激性，对皮肤无致敏性1Transcutol P理化性质和注册文件。。本研究发现丹参酮在二乙二醇单乙基醚中溶解能力较强，是在油相IPM中的2.6倍。二乙二醇单乙基醚的高溶解性能使其在发挥助表面活性剂作用的同时显著增加微乳制剂中脂溶性丹参酮的载药量。Censi R.等[17]的研究表明槲皮素溶解在微乳中或仅溶于二乙二醇单乙基醚中时，其透皮能力与槲皮素水溶液相比显著提高；刘志东等[18]的角膜渗透实验也证实，二乙二 醇单乙基醚能够增加水溶性药物的角膜透过量。本研究选择二乙二 醇单乙基醚作为助表面活性剂，在改善表面活性剂聚乙二醇十二羟基硬脂酸酯乳化能力的同时，能够显著增加脂溶性丹参酮在微乳制剂中的溶解度，并改善丹参复合微乳中两类药物的的经皮渗透能力，为本研究后续透皮实验的研究奠定了良好的基础。

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Study on Microemulsion Formulation of Radix Salvia Miltiorrhiza Containing Salvianolic Acid

Jiang Qiaoli, Liu Lehuan, Huang Ruixue, Mao Yuwei, Li Yijun, Zhai Wenwen, Dai Jundong
(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to optimize the formulation and preparation process of Salvia miltiorrhiza multicomponent microemulsion. Combined with pseudo three phase diagram method and simplex lattice design, particle size, entrapment efficiency and drug loading of microemulsion were selected as evaluation indexes. Experimental design and model establishment were performed by Expert Design 8.06 software. Final microemulsion formulation was optimized and validated by the response surface data analysis. It was found that the component proportion of the final optimized microemulsion formulation was as follows: ratio of isopropyl myristate (IPM) to Solutrol-HS 15-Transcutol P (4:1) to purified water was 13.3 to 31.7 to 55.0. Particle size of the final microemulsion formulation was 12.88±0.57 nm, while entrapment efficiency of tanshinone II 98.00±2.26%, and drug loading of tanshinone II A and salvianolic acid B 5.30±0.03, 2.43±0.01 mg·g-1, respectively. It was concluded that the high entrapment efficiency and drug loading rate of tanshinone II, small particle size were obtained in the microemulsion prepared by optimized formulation, which provided scientific basis for further development and application of Salvia miltiorrhiza multicomponent microemulsion.

Total salvianolic acid, total tanshinones, simplex lattice design, microemulsion, formulation optimization, content determination

10.11842/wst.2016.03.027

R283

A

（责任编辑：朱黎婷 张志华，责任译审：朱黎婷）

2015-11-04

修回日期：2015-11-26

＊ 北京中医药大学自主选题资助项目（2015-JYB-XS108）：丹参吸入粉雾剂的制备及其特发性肺纤维化的药效学评价，负责人：翟文文。

＊＊ 通讯作者：戴俊东，副教授，主要研究方向：分子药剂学与新型给药系统研究。