康莱特对Lewis肺癌小鼠TAM及E-cadherin、Vimentin表达的影响

李莉　陈红耀　韩晓丽　贺丽亚　张洪珍

050051　石家庄市，河北省人民医院中医科(李莉),耳鼻喉科(陈红耀、韩晓丽),肿瘤五科(贺丽亚、张洪珍)



·论著·

康莱特对Lewis肺癌小鼠TAM及E-cadherin、Vimentin表达的影响

李莉陈红耀韩晓丽贺丽亚张洪珍

050051石家庄市，河北省人民医院中医科(李莉),耳鼻喉科(陈红耀、韩晓丽),肿瘤五科(贺丽亚、张洪珍)

【摘要】目的研究康莱特注射液(KLT)对肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)及上皮间质化的关键因子上皮性钙黏蛋白(E-cadherin, E-cad)、波形蛋白(Vimentin)的影响。方法建立小鼠肺癌Lewis细胞移植瘤模型，设对照组和康莱特低、中、高剂量组作为对照，分别给0.9%氯化钠溶液:12.5 ml/kg、KLT:6.25、12.5、25 ml/kg，腹腔注射。称取小鼠体重、瘤重及脾脏重量；流式细胞技术(FCM)检测肿瘤组织中TAM比例；Western Blot检测上皮相关标志物E-cadherin和间质相关标志物Vimentin蛋白的表达。结果KLT注射液低剂量组、中剂量组、高剂量组的抑瘤率分别为2.63%、41.59%和50.21%。KLT高、中剂量组的瘤重、脾脏指数、TAM比例、E-cadherin、Vimentin与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论康莱特对Lewis肺癌小鼠肿瘤的生长具有一定的抑制作用，可能是通过影响肿瘤微环境中TAM细胞的数量，改善上皮间质化现象实现的。

【关键词】康莱特；Lewis肺癌；TAM；E-cadherin、Vimentin

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，发病率和病死率均居恶性肿瘤之首[1]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)是肿瘤免疫微环境中数量最多的细胞群，它可降低肿瘤细胞细胞角蛋白、E钙黏素(E-cadherin, E-cad)等上皮结构黏附蛋白的表达，升高波形蛋白(Vimentin)等间叶组织标记的表达，导致肿瘤发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[2]，即上皮细胞向间质细胞转化。研究表明，在肺癌的发生发展过程中TAM和EMT起着不可忽视的作用[3]。康莱特注射液(KLT)是一种薏苡油合成的中药制剂，主要提取自中药薏苡仁，不但具有抗肿瘤作用，还可提高患者免疫力，甚至逆转耐药[4]。抗肿瘤药物康莱特有望通过调节机体免疫功能，影响肿瘤微环境中TAM细胞的数量，改善肿瘤微环境，进而起到抗肿瘤的作用。本研究通过创建Lewis肺癌小鼠模型，研究康莱特注射液对瘤重、脾脏指数的影响及其对TAM比例、E-cadherin、Vimentin蛋白表达的调节作用。

1材料与方法

1.1实验材料与仪器健康雄性昆明小鼠，5～6周龄，体重18～20 g，购自河北省实验动物中心(动物合格证编号：1409008)，给予常规饲料喂养，不控制饮水，由河北省人民医院临研中心提供SPF级动物饲养室。Lewis肺癌细胞株购自河北医科大学免疫学教研室，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37℃，5% CO2的细胞培养箱中培养。康莱特注射液(规格：100 ml，10 g/瓶)购自浙江康莱特药业有限公司；四季青胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；DMEM高糖培养液购自美国Gibco公司。PE-CD11b、FITC-F4/80 mAb购自美国 eBioscience 公司。鼠抗人E-Cadhering、Vimnetin单克隆抗体、SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1Lewis小鼠模型的建立及分组干预：Lewis肺癌细胞株复苏后传代，取传至3～4代生长良好的Lewis肺癌细胞，台盼蓝计数活性>95%，配制细胞浓度为5×107个/ml的细胞悬液，0.2 ml/只注射于小鼠左前腋窝皮下。接种6～7 d后，小鼠左前腋皮下可触及2～3 mm直径硬结，移植瘤模型建立成功。隔日定时用游标卡尺测量肿瘤最长径a及最短径b，待最长径为0.8～1 cm时，舍弃肿瘤过大(ab>2.5 cm2)或过小(ab<0.20 cm2)的小鼠，挑选肿瘤大小较均一的荷瘤小鼠24只，随机分为对照组、康莱特低剂量组、康莱特中剂量组、康莱特高剂量组，每组6只，腹腔注射相应药物，分别为：0.9%氯化钠溶液12.5 ml/kg、KLT 6.25、12.5、25 ml/kg，2次注射之间间隔12 h，连续给药14 d。处死小鼠，剪开小鼠腋下皮肤，完整剥离肿瘤及脾脏。

1.2.2计算肿瘤抑制率和脾脏指数：分别称取小鼠体重、瘤重及脾脏重量，肿瘤抑制率=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。脾脏指数=脾脏重量(g)/小鼠体重(g)÷100。

1.2.3流式细胞仪检测肿瘤组织TAM比例：将部分肿瘤组织机械法制备成细胞悬液，加入PE-F4/80+和FITC-CD11b+抗体各2 μl，用流式细胞仪检测CD11b+F4/80+细胞含量。

1.2.4Western Blot检测肿瘤组织E-cadherin、Vimentin蛋白表达：剪取肿瘤组织0.25 g，严格按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取总蛋白，加入上样缓冲液然后煮沸样品5 min使蛋白变性，置于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，分离的蛋白转移至PVDF膜上之后，用5%脱脂奶粉配置的TBST室温封闭2 h，加入一抗(兔抗E-cadherin单克隆抗体1∶800、兔抗Vimentin多克隆抗体1∶1 000)孵育，4℃封闭过夜，TBST洗膜后辣根过氧化酶二抗室温孵育45 min，TBST洗膜15 min×3次，暗室ECL显影。以β-Actin为内参，测E-cadherin、Vimentin的蛋白表达，相对表达量为各蛋白与β-Actin显影条带灰度值的比值[5]。

2结果

2.1肿瘤抑制率和脾脏指数处死小鼠后，称取瘤重。KLT注射液高、中剂量组的瘤重与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。KLT低剂量组的瘤重与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。KLT注射液高、中、低剂量组对肿瘤的抑制率分别为50.21%、41.59%和2.63%。KLT高、中、低剂量组的脾脏指数均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　KLT对肿瘤抑制率及脾脏指数的影响　±s

注：与对照组比较，*P<0.05

2.24组肿瘤组织TAM比例KLT注射液高、中、低剂量组均低于对照组，其中KLT高、中剂量组与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；KLT低剂量组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3E-cadherin、Vimentin蛋白表达情况相比于对照组，E-cadherin在KLT高、中剂量组肿瘤组织中的表达增高，Vimentin蛋白的表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。KLT低剂量组肿瘤组织中E-cadherin、Vimentin蛋白与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表2KLT对小鼠肿瘤组织中TAM比例的影响

组别TAM对照组7.32±0.03KLT高剂量组4.80±0.03*KLT中剂量组4.86±0.02*KLT低剂量组6.20±0.04

注：与对照组比较，*P<0.05

表3KLT对小鼠肿瘤组织中E-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响

组别E-cadherinVimentin对照组0.37±0.030.38±0.03KLT高剂量组0.64±0.01*0.31±0.01*KLT中剂量组0.49±0.01*0.32±0.01*KLT低剂量组0.41±0.010.36±0.01

注：与对照组比较，*P<0.05

3讨论

康莱特注射液提取自中药薏苡仁，是经现代先进制药工艺制成的一种具有抗癌活性的中药制剂，其主要组分为中性油脂三酰甘油。研究表明康莱特注射液其对多种肿瘤细胞(肺、肝、脑、乳腺肿瘤等)均能有较强的杀伤及抑制作用[6]。

动物实验发现，KLT作用于肝癌移植瘤小鼠后，可将肿瘤细胞阻断在细胞周期的G2+M期，阻止部分细胞进入G0和G1期，减少有丝分裂的细胞数，抑制肿瘤细胞增殖[7]。Woo等[8]研究发现，康莱特注射液能够具有抑制体内外肿瘤生长的作用。本研究结果显示康莱特高、中、低剂量组的瘤重低于对照组，表明康莱特对Lewis肿瘤细胞有较强的抑制及杀伤作用，从而减少肿瘤的局部复发。

KLT作用于癌细胞主要是将其停滞在G2-M期，减少有丝分裂，促进细胞凋亡，并逆转多药耐药，还能够提高患者免疫力、改善生存质量[9-11]。脾脏作为免疫器官，脾脏指数可当作评价机体免疫功能的指标之一。Pan等[12]研究KLT对免疫功能的调节活性，发现腹腔注射KLT显著抑制Lewis肺癌细胞生长，KLT高低剂量组的脾脏指数显著高于生理盐水组。另有动物实验也显示，与CTX组相比，康莱特各剂量组的脾、胸腺指数明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)[13]。本研究结果显示康莱特高、中、低剂量组的脾脏指数明显低于对照组，且差异有统计学意义(P<0.05)，表明康莱特注射液对Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能具有一定的保护作用。李莉等[14]研究发现给晚期肺癌患者应用康莱特后，可提高CD3、CD4细胞活性，改善患者的免疫状态。肿瘤的发生、发展与肿瘤细胞生存所处的微环境(肿瘤微环境)有关。肿瘤微环境包括癌细胞、间质细胞、生物因子以及免疫细胞等[15]。肿瘤微环境包括免疫微环境、炎症微环境、酸性微环境、缺氧微环境等。

TAM主要包括M1(经典活化型)、M2(替代活化型)及其他亚型[16]。M1型可引起Th1免疫反应，对微生物和肿瘤细胞具有细胞毒活性；M2型具有免疫抑制作用，促进血管生成、组织重塑和肿瘤进展[17]。在肿瘤微环境中，TAM极化主要偏向M2表型[18]。研究显示，TAM参与了肿瘤新生血管生成、细胞外基质降解，还介导了肿瘤免疫逃逸，从而参与并促进了肿瘤发生、生长、侵袭和转移多个阶段[19,20]。TAM最主要的分子标记物CD68。

EMT是指受某些特殊生理或病理条件的影响，上皮细胞表型缺失并向成纤维细胞或间充质细胞表型转变，减弱细胞间的黏附作用，使细胞迁移和运动能力增强的现象[21]。E-cadherin表达下调及Vimentin蛋白表达上调是EMT重要特征[22]。Vimentin表达于上皮性肿瘤细胞，研究表明，发生上皮间质转化时Vimentin蛋白过表达，促进肿瘤的侵袭、转移[23,24]。

本研究进一步检测了肿瘤组织TAM的比例及E-cadherin、Vimentin蛋白的表达，结果发现康莱特高、中、低剂量组的TAM比例及Vimentin蛋白表达均低于对照组，而E-cadherin蛋白表达高于对照组，且康莱特高、中剂量组与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。此结果说明Lewis肺癌小鼠应用康莱特后，肿瘤组织中TAM比例降低，E-cadherin蛋白表达升高，而Vimentin蛋白表达降低，推断康莱特注射液对肿瘤免疫微环境及上皮间质化过程均有影响。

综上所述，KLT注射液一定程度上可抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤的生长，其可能的机制与抑制肿瘤组织中的TAM，从而抑制微血管生成有关；上调E-cadherin的表达水平，从而增加肿瘤细胞间的黏附能力有关；下调Vimentin表达水平，从而阻止肿瘤细胞的间质转化及侵袭有关。

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(收稿日期：2015-11-17)

【中图分类号】R 730.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)10-1512-03

通讯作者:张洪珍，050051石家庄市，河北省人民医院肿瘤五科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.020

E-mail：hongzhenzhang456@sohu.com