杜仲总黄酮对大鼠神经源性肌萎缩的影响

陈全利，胡 莉，魏 玮，李三华

(1.遵义医学院附属医院 针灸科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

杜仲总黄酮对大鼠神经源性肌萎缩的影响

陈全利1，胡 莉2，魏 玮1，李三华3

(1.遵义医学院附属医院 针灸科，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 病理科，贵州 遵义 563099；3.遵义医学院 医学与生物学研究中心，贵州 遵义 563099)

目的 观察杜仲总黄酮对大鼠神经源性肌萎缩的治疗效果。方法 以30只1月龄雌性SD大鼠作为实验动物，随机选取24只大鼠夹伤右后肢坐骨神经制作神经源性肌萎缩模型，并分为4组：模型组、杜仲总黄酮低、中、高剂量组；不做坐骨神经夹伤处理的剩余6只大鼠作为对照组。在自由饮食状态下，模型组和对照组不予以灌胃处理，杜仲总黄酮低、中、高剂量组采用灌胃方式分别喂饲TFE 50、100、200 mg/kg/d，共4周。实验处理结束后，各组大鼠麻醉处死取右后肢腓肠肌称重并制作HE染色切片测量肌细胞横截面积，Western blot方法检测肌肉组织中肌肉抑制素(MSTN)蛋白和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果 与对照组相比，模型组的腓肠肌重量和肌细胞的横截面积明显减少；给予杜仲总黄酮的各组中腓肠肌重量和肌细胞的横截面积也减少，但其减少程度较模型组降低，且与剂量呈正相关。与对照组相比，模型组中MSTN蛋白的表达量明显增多；杜仲总黄酮各组中MSTN蛋白与对照组相近，且各组间的表达量无统计学差异。与对照组相比，模型组中促凋亡蛋白Bax表达量明显增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表达量明显下降；杜仲总黄酮的各组中，当给予剂量达到100 mg/kg/d及以上时可明显抑制Bax的表达量和促进Bcl-2的表达量(P<0.05)。结论 杜仲总黄酮能改善神经损伤后SD大鼠的肌萎缩症状，可以通过调节MSTN蛋白、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达量而减少其肌肉重量和肌细胞大小的损失。

神经源性肌萎缩；杜仲；黄酮；腓肠肌；MSTN蛋白；Bax；Bcl-2

肌萎缩是指由于肌肉营养不良所导致的骨骼肌体积缩小、肌纤维变细甚至消失的一种疾病。其中由于神经肌肉接头之前的神经结构病变所引起的肌萎缩称之为神经源性肌萎缩，在临床上极为常见，其症状与祖国医学的经络受损相符，属“痿症”范畴。杜仲作为传统中药，主要有补肝肾、强筋骨的功效，常用于治疗肾阳虚之腰腿痛或酸软无力等；现代药理学研究表明，杜仲有多种活性成分(如木脂素类、萜娄、黄酮类、酚酸类等)和药理作用(如降低血压、抗氧化、抗骨质疏松和提高免疫力等)[1-3]；关于杜仲对神经源性肌萎缩是否有明确疗效的研究鲜见报道。本实验研究观察杜仲总黄酮(total flavones of cortex eucommia,TFE)对神经源性肌萎缩大鼠的作用效果，为肌萎缩的治疗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器 1月龄雌性SD大鼠购自第三军医大学大坪医院实验动物中心；杜仲购自遵义市中药材市场，经遵义医学院药学院张玉金副教授鉴定为杜仲(Eucommiaulmoides)。

紫外-可见分光光度计(日本岛津，UV-265-FW)，正置显微镜及组织细胞图像分析系统(德国徕卡，DM4000&Qwin)，凝胶成像仪(美国BIORAD，ChemiDocXRS)，全齿钳(上海医疗器械股份有限公司，JZO7CR)。芦丁(中国药品生物制品检定所，批号100080-200702)，肌肉抑制素(Myostatin，MSTN)兔多克隆抗体(19142-1-AP)、GAPDH兔多克隆抗体(10494-1-AP)、凋亡相关蛋白Bcl-2兔多克隆抗体(12789-1-AP)和凋亡相关蛋白Bax兔多克隆抗体(50599-2-lg)均为武汉三鹰生物技术有限公司产品，HRP标记山羊抗兔IgG(碧云天生物技术研究所，A0208)，ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所，P0018)。

1.2 方法

1.2.1 杜仲总黄酮的提取及含量测定 杜仲总黄酮的提取及含量测定参考文献[4-5]进行：杜仲树皮粉碎成粉末后过60目筛，精密称重1 000 g，加入60%乙醇12 000 mL，在微波功率200 W条件下加热提取20 min，过滤，提取2次，合并滤液，减压旋转蒸发后减压烘干至恒重，再经AB-8大孔吸附树脂纯化，采用70%乙醇洗脱、富集，浓缩干燥得到杜仲皮提取物，提取物和对照品芦丁均用甲醇溶解，与亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠混合后，在紫外-可见分光光度计中400～700 nm下进行扫描，提取物在510 nm有最大吸收峰，吸收光谱和芦丁相似，故杜仲皮提取物含有黄酮类物质。然后采用芦丁作为标准品，在紫外-可见分光光度计中510 nm波长下测量吸光度，绘制芦丁标准品曲线，得到芦丁标准品曲线的回归方程A=11.568C+0.002 15，R2=0.999 1，测量杜仲提取物的吸光度，根据回归方程计算出杜仲皮中的杜仲总黄酮的含量为5.79 mg/g。最后杜仲总黄酮用双蒸水配制成浓度为20 mg/mL的混悬液4 ℃保存备用。

1.2.2 神经性肌萎缩大鼠模型的复制 30只1月龄雌性SD大鼠[体重(100±12) g]，普通饲料适应性喂养1周后，按照随机数字表法随机选取24只大鼠，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，右侧臀部及股部剪毛备皮，俯卧固定于实验台上，常规消毒，自右侧臀部至股部连线，将皮肤斜行切开约12 mm，钝性分离皮下组织及肌肉，分离出右坐骨神经干约10 mm，并使之充分暴露，用全齿钳(JZO7CR)钳夹伤右坐骨神经干2次，每次5 s，间隔10 s，挤压伤的宽度为5 mm，使神经轴突断裂，保持神经外膜完整性，术毕伤口内注射硫酸庆大霉素1万单位，缝合皮肤并常规消毒。所有手术操作均严格遵循无菌原则；为减小操作产生的误差，手术操作均由同一人完成。剩余6只大鼠不做上述坐骨神经损伤术。

1.2.3 实验分组及处理 6只未手术的大鼠作为对照(CON)组；24只手术的大鼠按照随机数字表法随机分为4组：模型(MOD)组、TFE低剂量(TFEL)组、TFE中剂量(TFEM)组、TFE高剂量(TFEH)组。从术后第2日开始，在自由饮食条件下，分别做如下处理：CON组和MOD组不予以灌胃处理；TFEL组予以灌胃TFE 50 mg/kg/d；TFEM组予以灌胃TFE 100 mg/kg/d；TFEH组予以灌胃TFE 200 mg/kg/d；实验处理持续4周，每周灌胃时间为连续的5 d。

1.2.4 实验指标检测 实验结束后完整取下每只大鼠的右后肢腓肠肌称湿重量。取部分肌肉组织甲醛固定石蜡包埋后制作切片并进行HE染色，徕卡正置显微镜200倍放大倍数下观察，每组取12个固定面积视野内的肌细胞采用徕卡组织细胞图像分析系统测量细胞的平均横截面积。取部分肌肉组织提取总蛋白质，用Western blot方法检测MSTN、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况：取50 mg肌肉充分剪碎，加入RAPI裂解液250 μL和终浓度为1 mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF，组织匀浆器中充分研磨并超声波粉碎，冰上裂解20 min，14 000 r/min离心20 min，取上清液，用BCA法测定蛋白浓度；采用SDS-PAGE电泳(浓缩胶浓度为4%，分离胶浓度为12%，电压100 v，2 h)，每组加样10 μg，总蛋白质，电泳结束后用PVDF膜，200 mA恒流，电转40 min；最后进行如下操作：封闭液室温封闭2 h→4 ℃一抗孵育过夜→室温二抗孵育2 h→ECL试剂结合→凝胶成像仪曝光采集图像，实验重复3次。

1.3 统计学分析 所有实验数据采用统计软件SPSS 13.0中单因素方差分析LSD法进行组间均数比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 腓肠肌重量和肌细胞面积比较 与CON组相比，MOD组右后肢腓肠肌的重量和肌细胞的横截面积明显减少。TFEL组、TFEM组、TFEH组右后肢腓肠肌的重量和肌细胞的横截面积减少量较MOD组有所回升，但仍明显低于CON组；在抑制腓肠肌的重量减少时，TFEH组的效果好于TFEL组和TFEM组；在抑制肌细胞横截面积缩小时，TFEM组和TFEH组具有相近的效果且优于TFEL组(P<0.05，见表1)。

CON组的腓肠肌中肌细胞分布均匀，排列整齐，而坐骨神经损伤后的各组中结缔组织增多，细胞排列紊乱，肌细胞横截面积参差不齐(见图1)。结果表明，杜仲总黄酮能缓解坐骨神经损伤后SD大鼠腓肠肌的重量丢失和细胞大小的缩小。

表1 腓肠肌湿重及肌细胞横截面积比较

组别腓肠肌湿重(g)肌细胞横截面积(μm2)CON0592±0017106283±9474MOD0315±0032★63958±5291★TFEL0356±0031★▼73941±5493★▼TFEM0436±0028★▼△79803±5731★▼△TFEH0479±0027★▼△◆82233±6491★▼△

★表示与CON组比较，P<0.05；▼表示与MOD组比较，P<0.05；△表示与TFEL组比较，P<0.05；◆表示与TFEM组比较，P<0.05。

A：CON组；B：MOD组；C：TFEL组；D：TFEM组；E：TFEH组。图1 腓肠肌HE染色切片

2.2 MSTN、Bax和 Bcl-2蛋白的检测 从图2B中可以看到，与CON组相比，MOD组的MSTN表达量明显增加(P<0.05)，TFEL组、TFEM组、TFEH组的MSTN表达量相近且均低于MOD组(P<0.05)。从图2C中可以看到，与CON组相比，MOD组和TFEL组的Bax表达量明显增加(P<0.05)；与MOD组相比，TFE组中Bax的表达量均明显下降，且TFEM组和TFEH组的Bax表达量相近并低于TFEL组。从图2D中可以看到，与CON组相比，MOD组、TFEL和TFEM组的Bcl-2表达量明显下降(P<0.05)；与MOD组相比，TFEM组和TFEH组的Bcl-2表达量增加(P<0.05)且两组的表达量相近(见图2)。结果表明，杜仲总黄酮在剂量为50 mg/kg/d时已能降低坐骨神经损伤后腓肠肌中MSTN的表达，当剂量达到100 mg/kg/d及以上时可显著抑制促凋亡蛋白Bax的表达和促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

A：western blot检测结果；B：MSTN蛋白相对表达量；C：Bax蛋白相对表达量；D：Bcl-2蛋白相对表达量。★表示与CON组比较，P<0.05；▼表示与MOD组比较，P<0.05；△表示与TFEL组比较，P<0.05；◆表示与TFEM组比较，P<0.05。图2 MSTN、Bax和Bcl-2蛋白表达检测结果

3 讨论

骨骼肌是周围神经系统的靶器官，其结构的完整和功能的维持受到神经元的支配和调节，一旦神经元任何部位受到损伤时，肌肉则发生快速和严重的萎缩[6-7]，出现肢体筋脉弛缓、软弱无力，日久不能随意运动之“痿证”。

黄酮类化合物是一类多酚化合物，属植物次级代谢产物，广泛存在于药用植物、水果、蔬菜等中。有研究发现给健康大鼠喂饲大豆黄酮后，腓肠肌的肌纤维增大和肌肉重量增加[8]；日本科学家发现啤酒花中的异戊烯基黄酮类化合物可以抑制大鼠废用性肌萎缩[9]，因此黄酮类物质用来防治肌肉萎缩是有潜在可行性；而黄酮类物质作为杜仲中常见的一种活性物质，主要包括槲皮素、山奈酚、紫云英苷和芦丁[10-11]等，具有抗骨质疏松和抗氧化等作用[1-2]；在本实验研究中发现其可以抑制神经损伤后的肌肉萎缩，进一步佐证了杜仲在中医中常用来治疗“痿症”的功效。

肌肉生长抑制素(MSTN)，又称为生长分化因子-8(GDF-8)，属转化生长因子β(TGF-β)家族成员，是近年来发现的一种重要的肌细胞生长调控因子。MSTN在骨骼肌大量表达，对骨骼肌生长具有强大的负调控能力。大量研究证实，不管是在MSTN表达缺失的动物[12-13]，还是在MSTN突变的人群[14]，均出现了异常的肌肉肥大；MSTN过表达时则诱导小鼠骨骼肌萎缩[15-16]，并且在肌肉萎缩的动物模型[17]和临床患者[18-19]均出现骨骼肌中MSTN表达的显著增强，提示MSTN参与了骨骼肌结构和功能的生理和病理生理调节。本实验研究中，SD大鼠的坐骨神经损伤后，腓肠肌MSTN蛋白的表达量升高，表明MSTN的确参与了失去神经支配后的肌肉萎缩过程，而杜仲总黄酮剂量为50 mg/kg/d时已能有效降低它的表达。

细胞凋亡是内源性基因调控的主动、有序的细胞自杀性死亡过程，研究证实细胞凋亡参与了肌萎缩。Schmalbruch[20]观察到萎缩骨骼肌细胞出现细胞皱缩、核固缩、染色质浓缩等与凋亡相似的形态改变，Yoshimura等[21]发现了失神经支配后的骨骼肌在萎缩过程中的细胞凋亡。由于肌细胞是多核细胞，凋亡初期只累及少部分细胞核，其他细胞核保持完整性而使细胞存活相当长一段时间且具有一定功能；随着凋亡持续发展，当发生凋亡的细胞逐渐增加和正常的细胞核数量逐渐下降，肌肉也逐渐失去功能，这也是长期失神经支配骨骼肌功能恢复欠佳的主要原因之一。多种基因家族参与多种通路调控细胞凋亡，比如Bcl家族、caspase家族、癌基因C-myc家族等。Bcl家族蛋白在线粒体介导的凋亡通路中起重要调节作用，该家族蛋白可分为2类，分别具有抗凋亡和促凋亡的作用，其中Bcl-2和Bax这一对功能基因在细胞凋亡过程中起关键作用，两者水平的高低直接决定细胞的命运：Bax表达增加时促进细胞凋亡，而Bcl-2表达增加时则抑制细胞凋亡。本实验研究发现，SD大鼠坐骨神经损伤后腓肠肌中促凋亡的Bax蛋白表达增加了，而抑凋亡的Bcl-2蛋白表达下降了，表明Bcl-2和Bax确实参与了神经损伤后肌肉的萎缩；杜仲总黄酮剂量达到100 mg/kg/d及以上时能显著降低Bax的表达和提高Bcl-2的表达，其机理还需进一步实验验证。

综上所述，SD大鼠骨骼肌失神经支配后，肌肉逐渐萎缩；杜仲总黄酮可以通过调节MSTN蛋白和凋亡调控蛋白Bcl-2和Bax的表达，减少肌肉重量和肌细胞大小的损失，从而抑制神经损伤后导致的肌肉萎缩。

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[收稿2016-10-05;修回2016-11-13]

(编辑：王静)

Effect of total flavones of cortex eucommia on neurogenic muscular atrophy rat

ChenQuanli1,HuLi2,WeiWei1,LiSanhua3

(1.Department of Acupuncture,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Pathology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Research Center for Medicine and Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the effect of total flavones of Cortex Eucommia (TFE) on neurogenic muscular atrophy rats.Methods 30 one-month old female Sprague Dawley rats were used.24 rats were picked randomly to crush right sciatic nerves and divided into model group (MOD),group of low dose of TFE (TFEL),group of medial dose of TFE (TFEM) and group of high dose of TFE (TFEH).The rest rats without crush sciatic nerves were used as control group (CON).The rats of MOD and CON groups were fed food and water freely without extra administration.The rats of TFEL,TFEM and TFEH groups (TFE groups) were given TFE at 50,100 and 200 mg/kg/d,respectively via intragastric administration for 4 weeks.All rats were sacrificed after anaesthesia.Gastrocnemius muscles of right hind leg of rats was cut to measure the weight and size of muscle cells.In addition,Myostatin (MSTN) protein and apoptosis related protein Bax and Bcl-2 were examined by Western blot.Results Compared with control group,the muscle mass and cells’ size of model group were declined markedly.When TFE groups were administrated TFE,alleviative effects emerged and had a positive correlation with the concentration of TFE.Compared with control group,the expression of MSTN of model group was higher.The expressions of MSTN of three TFE groups were similar to control group and each TFE group had no difference.The expression of Bax of model group was higher while Bcl-2 was lower than control group.When the doses of TFE were greater than 100 mg/kg/d,the expression of Bax was lower and Bcl-2 was higher than those in model group (P<0.05).Conclusion TFE alleviates the muscular atrophy symptom of SD rats after their sciatic nerve crush,possibly mediated through regulating the expression of MSTN,Bax and Bcl-2 and ultimately resulting in less loss of muscle mass and cells’ size.

neurogenic muscular atrophy; cortex eucommia; flavones; musculus gastrocnemius; MSTN protein; Bax; Bcl-2

贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术基金资助项目(NO：QYZZ20)。

李三华，女，硕士，副教授，研究方向：老年疾病，E-mail:lshvera521@163.com。

R965

A

1000-2715(2016)06-0563-05