灵芝孢子粉对亚急性镉中毒大鼠肾脏的保护作用

冯 扬，胡曦尹，杨 城，付腾腾，单冰冰，黄厚今

(遵义医学院 公共卫生学院毒理学教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

灵芝孢子粉对亚急性镉中毒大鼠肾脏的保护作用

冯 扬，胡曦尹，杨 城，付腾腾，单冰冰，黄厚今

(遵义医学院 公共卫生学院毒理学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 研究灵芝孢子粉(GLS)对亚急性镉中毒大鼠肾脏的保护作用。方法 雄性SD大鼠50只，按体重分层后，采用随机数字法分为5组，每组10只，即正常对照组(C组)、单独染镉组(Cd组)和3个给药组(0.1、0.5、1.0 g/kg GLS+CdCl2，即GCdL组、GCdM组、GCdH组)。除C组外，其它组大鼠每天灌胃CdCl2(6.5 mg/kg)，3个给药组每天灌胃灵芝孢子粉悬浊液，C组和Cd组灌等体积生理盐水，持续42 d，定期称重并观察动物的一般表现。染毒结束后麻醉、取血、取肾脏；血生化检测肾功能相关指标；原子吸收光谱法(AAS)检测肾组织及其线粒体、微粒体等亚细胞器中镉的含量；肾脏病理HE染色切片观察病理组织学改变。结果 与C组比较Cd组肌酐、尿素、尿酸、胱抑素-c均有不同程度升高，给予GLS干预后，各项指标有不同程度降低，GCdM组、GCdH组肌酐变化与Cd组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；给予灵芝孢子粉干预后，镉在各亚细胞器中有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)；HE染色显示，单独染镉组肾组织细胞间质充血严重，细胞排列杂乱，细胞边界不清晰，肾小管管腔不明显，核溶解情况严重，而给药组以上情况均有不同程度改善，并且高剂量组效果优于中剂量组。结论 灵芝孢子粉对亚急性镉中毒大鼠肾脏有保护作用。

灵芝孢子粉；大鼠肾脏；氯化镉；亚细胞器；保护

镉(Cd)作为一种毒性极强的环境污染物，以各种无机化合物的形式广泛分布于自然界中，在联合国环境规划署提出的12种具有全球性意义的危险化合物中，镉被列为首位[1]。人接触镉会引起机体的毒性反应[2]，长期接触则会有肿瘤发生的风险[3-4]。镉的半衰期长(10～25年)，排泄率低，经呼吸道和消化道进入机体后容易在体内蓄积，会对肾、肝、肺和血液系统产生一系列的损伤[5-6]。肾脏损伤是镉对人体造成的主要危害[7]，研究表明：全球普通人群所患的慢性肾脏疾病中有7%是镉所致[8]。

近年来，镉中毒治疗多使用螯合剂，而镉与螯合剂会形成亲脂性较大的螯合物，致使镉在脑组织重新分布，产生严重的副作用[9]。中药防治镉中毒具有时间短、疗效好和毒副作用少等特点[10]，是防治镉中毒的理想药物来源。本课题组前期研究发现灵芝孢子粉(GLS)对急性镉中毒小鼠肝脏具有保护作用[11]，本实验在此基础上进一步研究GLS对亚急性大鼠肾脏的保护作用，为开发镉中毒的中药产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物和分组 健康成年雄性SD大鼠50只，体重180～240 g，清洁级，由第三军医大学大坪医院动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。动物室自然节律采光，室温(22±2) ℃、湿度(60±5)%、普通饲料喂养，自由饮水。适应性喂养7 d后随机分成5组：正常对照组(C组)、单独染镉组(Cd组)、GLS给药组(0.1、0.5、1.0 g/kg GLS+CdCl2，即：GCdL、GCdM、GCdH)[12]，除C组外，各组大鼠每天灌胃CdCl2(6.5 mg/kg)[13]，1 h后GLS给药组灌对应的GLS剂量，C组和Cd组灌等体积生理盐水。实验过程中观察大鼠的一般表现并定期称重，连续染毒42 d；染毒结束后禁食12 h，麻醉，腹腔主动脉取血并分离血清用全自动血生化分析仪检测尿素、尿酸、肌酐等肾功能指标，取肾脏。

1.2 药品、试剂与仪器 GLS(灵芝孢子粉)由贵州吉仁堂药片厂提供，氯化镉(CdCl2)由美国sigma公司提供(纯度99.999%)，苏木精-伊红(HE)染色液(湖北百奥斯生物科技有限公司)；甲醛溶液(成都科龙化工试剂厂)；浓HNO3由重庆川江化学试剂厂提供，蔗糖、PBS购于Sangon生物；Varian/AA240石墨炉原子吸收仪(美国瓦里安有限公司)；Fx-200电子分析天平(日本A&D公司)；贝克曼库尔特AU5800系列全自动生化分析仪(美国Backman Coulter公司)。

1.3 AAS检测肾组织及各细胞器Cd含量 称取50 mg肾脏组织加入1 mL 0.25 mol/L蔗糖溶液，玻璃匀浆器匀浆，用差速离心机分离组织匀浆液(kindey)中各细胞器。离心(600×g，10 min)取上清液，上清液离心(10 000×g，10 min)沉淀为线粒体(Mit)，取上清离心(20 000×g，30 min)沉淀为微粒体(Mic)，最终上清液为细胞质(Cyt)。分离出的各细胞亚细胞器和组织匀浆液分别加入1.5 mL浓硝酸消化，过夜。最后用0.5%稀硝酸定容，上机检测。测定条件：波长228.8 nm，狭缝0.5 nm，镉灯背景校正，浓度、峰高定量，灯电流 14.0 mA，进样体积20.0 mL，最大吸光度0.7 A，氩气环境：10 mL、1.1 mg/L溶液吸光度约0.2 Abs，灰化温度300 ℃，原子化温度1 800 ℃。

1.4 肾组织病理学观察 连续染毒42 d后，各组取大鼠4只，腹腔麻醉后迅速打开腹腔，腹腔主动脉取血，取肾脏，剔除筋膜，放于10%的甲醛溶液中固定，然后脱水、石蜡包埋、5 μm切片和HE染色，普通光学显微镜下观察肾脏组织病理学改变。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 染毒期间，正常对照组大鼠活动、饮水和饮食均正常。随着染毒时间的延长，各剂量组大鼠出现对刺激敏感，毛发杂乱，饮食量减少等表现。染毒26 d时，各剂量组大鼠出现不同程度的腹泻；染毒34 d时，各剂量大鼠有口鼻部发红，口腔分泌物增加等表现。到染毒结束时，Cd组和GCdL组大鼠均出现口鼻部发红的表现。

2.2 肾功能血清学变化 与对照组比较，Cd组的尿酸、尿素、胱抑素-c、肌酐明显升高，有GLS干预的剂量组与Cd组比较，尿酸、尿素、胱抑素-c、肌酐含量均有不同程度降低。其中Cd组、GCdL组肌酐变化与C组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；GCdM组、GCdH组肌酐变化与Cd组比较，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

组别尿素尿酸胱抑素-c肌酐C670±0971354±4234111±0354020±421Cd755±0881566±5728135±0484840±422∗GCdL753±0581514±4293132±0674660±434∗GCdM737±0651414±2701122±0554340±241#GCdH680±0371372±4293119±0594200±122#F1610022401764550P0211092209480009

*：与C组比较，P<0.05；#：与Cd组比较，P<0.05。

2.3 肾脏组织及其各亚细胞Cd的含量分布 给予灵芝孢子粉的大鼠肾脏中，镉大部分存在于细胞质中，而线粒体和微粒体的镉含量较少，单独染镉组肾组织、线粒体、微粒体镉含量均比GCdL、GCdM、GCdH组高，差异有统计学意义(P<0.05)；在细胞质中，GCdM、GCdH组镉含量较单独染镉组和GCdL组低，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

组别KidneyMitMicCytCd5203±490581±087227±0132224±434GCdL3984±737∗476±079164±039∗1949±282GCdM2858±382∗#407±050∗112±024∗#1363±161∗#GCdH2467±237∗#340±136∗#090±008∗#1126±190∗#

*：与Cd组比较，P<0.05；#：与GCdL组比较，P<0.05。

2.4 肾组织的病理组织学改变 由图1可见，正常组肾脏组织细胞浆分布均匀，肾小管管腔明显，细胞排列紧密，有规则，细胞边界清晰，无间质充血。与正常对照组比较，单独染镉组肾组织间质充血明显，肾小管形态不规则，细胞排列杂乱，细胞边界不清晰，细胞水肿明显。灵芝孢子粉干预处理明显改善肾脏损伤，肾组织间质充血减轻，细胞水肿减轻，未见核固缩、核溶解现象，细胞边界逐渐清晰，且灵芝孢子粉高剂量组效果较低剂量组明显。

A：对照组；B：单独染镉组；C：GCdM组；D：GCdH组。Cd组与对照组比较肾小管形态明显不规则，管腔腔隙缩小，细胞水肿明显，部分细胞出现核固缩、核溶解；给药组与Cd组比较肾小管损伤均有不同程度改善(如图箭头所示)。图1 各组大鼠肾脏组织病理学(HE，×400)

3 讨论

随着经济和工业的发展，重金属污染备受关注，人们可从环境和食物中摄入镉在机体蓄积，从而导致急慢性镉中毒[14]。目前，尚无较好的拮抗镉中毒的手段，当发生急性食入性镉中毒时，主要给予大量补液、注射阿托品止吐和消除腹痛等对症治疗，而金属螯合剂，如依地酸二钙钠非但不能拮抗镉毒性，甚至有加重毒作用的可能。而研究发现天然产物如蒲公英黄酮和大蒜混合物对拮抗镉中毒有一定效果的[15]。因此，从天然产物中寻找对抗镉毒性的解毒剂有重要意义。

已有研究证实：灵芝对顺铂诱导的肾脏损伤、阿霉素诱导的肾脏损伤、链脲佐菌素诱导的肾脏损伤均发现不同程度的保护作用[16-18]；临床研究也表明：灵芝制剂可以作为治疗药或辅助治疗药[19]。灵芝孢子粉的药效在多方面超过母体灵芝[20]，它除具有灵芝的全部遗传活性物质外，还含有比灵芝更丰富的多糖肽、腺嘌呤核苷、蛋白质、酶类、硒元素等特殊成份[21]，由此推测，灵芝孢子粉对镉所致的亚急性肾脏损伤可能有保护作用。本实验通过对灵芝孢子粉的研究，为以后治疗亚急性镉中毒寻求新的治疗药物。实验结果显示，单独染镉组大鼠的尿素、尿酸、胱抑素-c、肌酐含量明显升高。肌酐是肾脏排泄产物，由肌肉中肌酸分解产生，其升高的原因可能是氯化镉损伤肾小球，使肾小球滤过率下降，肌酐排泄受影响，致使血肌酐含量升高；由于毒物损伤肾小管，使肾小管分泌功能受到抑制，致使血尿酸升高；随着灵芝孢子粉的剂量增加，灵芝孢子粉干预组大鼠血清肌酐含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。说明灵芝孢子粉对亚急性镉中毒大鼠肾脏有保护作用。

镉在亚细胞水平上的靶器官主要是线粒体、微粒体等亚细胞器，如果药物能有效阻止或减少镉离子进入这些细胞器，就可以将镉与靶细胞器隔离，达到阻止镉诱导的氧化应激，从而达到减小毒物毒作用的目的[22]。由本文可知，镉在细胞质中含量明显高于线粒体和微粒体；给予灵芝孢子粉干预的大鼠较单独染镉组大鼠线粒体和微粒体的镉含量低(P<0.05)。说明灵芝孢子粉能有效的降低各亚细胞器内的镉含量，从而减小镉的毒作用，达到对亚急性镉中毒大鼠肾脏保护的作用。

本实验研究表明灵芝孢子粉具有拮抗亚急性镉中毒所致的的肾脏毒性作用，减少镉在肾脏和各细胞亚器中的蓄积从而降低镉的毒性作用，能够为镉中毒的药物开发提供理论依据。

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收稿2016-10-10;修回2016-11-12〗

(编辑：王静)

Protective effects ofGanodermalucidumspore on subacute cadmium nephrotoxicity in male rat

FengYang,HuXiyin,YangCheng,FuTengteng,ShanBingbing,HuangHoujin

(Department of Toxicology,School of Public Health，Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the protection of Ganodermalucidum spore (GLS) on subacute cadmium-induced kidney injuryin male rats.Methods 50 male SD rats were randomly assigned to control group (C,saline + saline,by gavage),Cd group [Cd,CdCl2(6.5 mg/kg) + saline,by gavage],and 3 treatment groups:GCdL[CdCl2(6.5 mg/kg) + GLS (0.1 g/kg),by gavage],GCdM[CdCl2(6.5 mg/kg)+GLS(0.5 g/kg),by gavage],GCdH[CdCl2(6.5 mg/kg)+GLS(1.0 g/kg),by gavage],10 in each group,all were treated for 42 days.Rats were weighed regularly,and observed for normal behavior.At the completion of the experiment,rats were sacrificed with anaesthesia,and blood was sampled fromabdominal aorta forbiochemical tests,and kidneys were stored frozen.The cadmium conten sink idney and subcellular components were tested by atomic-absorption spectrophotometer,and kidneys were examined by pathological sections.Results Compared with Cd group,creatinine,urea,uric acid,serum cystatin-c were reduced in treatment group,and creatinine in GCdM,GCdHwere significantly reduced (P<0.05).The cadmium content of subcellular was reduced after giving GLS (P<0.05).Kidney H&E staining showed that kidneys from Cd group rats showed more engorgement of the interstitium,tubular dilatation,tubular atrophy,karyolysis of tubular epithelial cells than the kidneys of GLS treated rats,and the treatment effect of high dose was much better than medium dose.Conclusion GLS has protective effects against Cd-induced chronic kidney injury in rats.

Ganodermalucidumspore;rat kidney;CdCl2;subcellular organelle;protection

贵州省优秀科技教育人才省长专项基金资助项目(NO：黔科教200904)。

黄厚今，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：营养毒理学，E-mail:1026553087@qq.com。

R114

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1000-2715(2016)06-0573-04