新型含氮芥席夫碱化合物的合成及其抗肿瘤活性研究

郑 微，宋文婷，曹亚萍，袁付明，袁泽利

(遵义医学院 药学院无机化学教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

新型含氮芥席夫碱化合物的合成及其抗肿瘤活性研究

郑 微，宋文婷，曹亚萍，袁付明，袁泽利

(遵义医学院 药学院无机化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 开发新的含芳香氮芥席夫碱化合物并考察其抗肿瘤活性。方法 设计了系列含芳香氮芥的新席夫碱化合物(1～4)，通过1H NMR、13C NMR、HRMS、FT-IR等对其结构进行表征，并探讨目标化合物3的最佳合成条件：以乙醇做溶剂，1,4-丁二胺与4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛投料比(摩尔比)为1∶2，80 ℃条件下回流反应2 h，产率在76%以上。用MTT法测定目标化合物对A549(人肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞)的体外抗肿瘤活性。结果 成功合成了4个新的含芳香氮芥席夫碱化合物。体外抗肿瘤活性结果表明，化合物1和2对两种受试细胞株均表现出优于临床药物美法仑的细胞毒性。而化合物1、2和3对HepG2细胞株的细胞毒性均表现出优于临床药物美法仑的细胞毒性。结论 设计合成的新含芳香氮芥席夫碱化合物1和2具有体外抗肿瘤活性的潜在优势，值得进一步研究。

席夫碱；氮芥；合成；抗肿瘤活性

作为一类重要的烷基化抗肿瘤药物，氮芥类化合物如美法仑、苯丁酸氮芥等在临床上已得到广泛应用[1-4]。该类抗肿瘤药物结构主要由烷基化部分和载体部分组成。烷基化结构部分是抗肿瘤活性的药效基团，载体部分主要用以改善药物在体内的吸收、分布等药动学性质，从而影响药物的毒性、选择性和抗肿瘤活性。此类药物具有选择性差、毒性大的特点[1-2]，在临床抗肿瘤的同时，对其他正常细胞也有较强抑制作用，产生严重的毒副反应，影响其临床应用[2]。为了克服此类药物的结构缺陷，对氮芥的结构修饰尤其是载体部分的修饰一直是药物化学的一个热点研究领域[5-7]。

研究证实含CH=N官能团结构的席夫碱化合物具有抗菌、抗肿瘤等药理活性[8-12]。为实现药物的抗肿瘤活性叠加，本研究制备了4个新的含氮芥的席夫碱化合物1～4，并通过MTT法研究了它们对A549(人肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞)的体外抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂 Varian 1 000 FT-IR红外光谱仪(4 000～400 cm-1,KBr压片，美国Varian公司)；Micromass LCT PremierXE高分辨质谱仪(德国 Bruker 公司)；安捷伦400 MHz-DD2磁共振仪(美国安捷伦公司)；IX71三色荧光奥林巴斯研究级倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；3131型二氧化碳培养箱(美国Thermo Scientific Varioskan Flash 公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(苏州苏净公司)。

间氨基酚(分析纯)、2-氯乙醇(分析纯)、CaCO3(分析纯)购置安奈吉化学试剂公司，其余所用试剂均为分析纯，且未进行特殊处理。胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；HyClone DMEM/HIGH GLUCOSE(1X)[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司]；胰蛋白酶-EDTA消化液、青链霉素混合液(100×)和MTT (北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 方法 目标化合物1～4的合成路线见图1。

图1 目标化合物1～4的合成

1.2.1 4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛的合成 参照文献[13-14]的方法进行。称取间氨基酚3.30 g(30.2 mmol)、2-氯乙醇 21 mL(310.0 mmol)及CaCO37.1 g(70 mmol)，同时倾入200 mL 蒸馏水中，加热搅拌，再称取KI 0.03 g置于上述反应混合液中，100 ℃回流18 h，经TLC监测反应完成后，滤去固体，水相用5×60 mL乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸干溶剂经层析柱分离，用乙酸乙酯∶石油醚(60～90 ℃)=3∶1(v∶v)进行洗脱，得1.84 g淡黄色油状物，产率29.2%。量取3 mL无水DMF于50 mL反应瓶中，再量取1.8 mL (19.0 mmol) POCl3，将其置于低温(-10 ℃)搅拌20 min。另称取1.08 g(5.5 mmol)上述淡黄色油状物，用3 mL无水DMF溶解，缓慢滴入上述反应体系中，滴毕。将此反应液升温至75～80 ℃继续反应2 h后，将反应液倾入100 mL冰水中，并用2 mol/L NaOH调pH至6～7，继续搅拌2 h，用4×25 mL乙醚萃取，无水硫酸镁干燥有机相，蒸出乙醚，粗品经层析柱洗脱，用乙酸乙酯:石油醚(60～90 ℃)=1∶5(v∶v) 洗脱，得淡黄色固体，产率61.7%。m.p.:60.8～61.2 ℃;1H NMR (CDCl3):δ(ppm) 11.53(s,1H,OH),9.59(s,1H,CHO),7.35～7.37(d,1H,J=8.8 Hz,Ar-H),6.2～6.32(m,1H,Ar-H),6.12～6.13(d,1H,J=2.3 Hz,Ar-H),3.79～3.83(t,4H,J=6.9 Hz,CH2),3.65～3.69(t,4H,J=6.8 Hz,CH2);13C NMR(CDCl3):δ(ppm)193.34,164.56,153.46,136.07,113.15,104.76,98.34,53.69,40.37。

1.2.2 目标化合物1～4的合成 以化合物1的合成为例：将4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛0.43 g(1.63 mmol) 溶解于10 mL无水甲醇中。再将乙二胺0.05 g(0.83 mmol)用10 mL无水甲醇溶解，并在氮气保护下滴入上述体系中。加热回流2 h，浓缩反应液至原体积的一半并将其置于-10 ℃下搅拌4 h，有淡黄色固体析出，过滤并用冷冻甲醇洗涤数次，真空干燥，得淡黄色固体。按同样操作步骤，化合物2～4。

化合物1：产率76.0%;m.p.:164.7～165.0 ℃.1H NMR(DMSO-d6):δ(ppm) 13.63 (s,2H,OH),8.29(s,2H,CH=N),7.14～7.16(d,2H,J=8.3 Hz,Ar-H),6.25～6.27(d,2H,J=8.4 Hz,Ar-H),6.04(s,2H,Ar-H),3.76(s,4H,-CH2CH2-),3.73(s,16H);13C NMR(DMSO-d6):δ(ppm) 165.17,164.58,150.20,133.22,109.18,103.10,98.38,57.63,51.84,41.02;HRMS(ESI-MS),理论计算值C24H31Cl4N4O2:549.1172 (M++H),实测值:549.115 8(M++H);FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 447,2 956,2 903,2 849,1 619,1 570,1 525,1 454,1 357,1 290,1 198,1 141,1 040,912,843,793,706。

化合物2：产率91.4%;m.p.:174.2～174.9 ℃.1H NMR(CDCl3):δ(ppm) 13.73(s,2H,OH),8.11(s,1H,CH=N),8.04(s,1H,CH=N),7.02(s,2H,Ar-H),6.11(s,4H,Ar-H),3.69(s,8H,-CH2CH2-),3.60(s,8H,-CH2CH2-),2.02～2.04(d,1H,J=8.6 Hz,CH),1.33(s,3H,CH3),1.22～1.25 (m,1H);13C NMR (CDCl3):δ(ppm) 165.30,164.65,164.57,162.88,149.96,149.78,133.27,133.22,109.86,102.95,99.08,99.00,69.26,63.90,59.14,53.26,40.33,21.35,21.07,20.32,16.56,14.22;HRMS(ESI-MS),理论计算值C25H33Cl4N4O2:563.1328 (M++H),实测值:563.130 6(M++H);FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 420,3 084,2 964,2 926,2 874,1 616,1 519,1 445,1 414,1 352,1 145,1 037,828,786,745。

化合物3：产率89.6%;m.p.:181.3～181.7 ℃.1H NMR(DMSO-d6):δ(ppm) 13.82(s,1H,OH),8.27(s,2H,CH=N),7.14～7.16(d,2H,J=8.3 Hz,Ar-H),6.24～6.26(d,2H,J=8.4 Hz,Ar-H),6.03(s,2H,Ar-H),3.73(s,16H),3.52(s,4H,-CH2CH2-),1.63(s,4H,-CH2CH2-);13C NMR (DMSO-d6):δ(ppm) 165.62,164.09,150.30,133.22,109.12,102.94,98.52,55.96,48.60,28.15;H RMS(ESI-MS),理论计算值C24H31Cl4N4O2:577.1485(M++H),实测值:577.1458 (M++H);FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 429,2 941,2 862,1 608,1 520,1 347,1 250,1 182,999,913,825,769。

化合物4：产率89.6%;m.p.:172.0～172.7 ℃;1H NMR(CDCl3) :δ(ppm) 13.69(s,2H,OH),8.46(s,2H,CH=N),7.21～7.22(d,2H,J=7.2 Hz,Ar-H),6.23～6.27 (m,3H,Ar-H),3.75～3.76(d,8H,J=6.2 Hz,-CH2-),3.65～3.67(d,8H,J=6.0 Hz,-CH2-);13C NMR (CDCl3):δ(ppm) 164.19,161.08,150.43,142.20,134.07,126.80,119.13,110.95,103.63,99.14,53.37,40.26;H RMS (ESI-MS),理论计算值C28H31Cl4N4O2:577.1485(M++H),实测值:577.132 2(M++H);FT-IR(4 000～400 cm-1,KBr压片):3 503,3 086,2 957,2 919,1 623,1 577,1 518,1 432,1 344,1 199,840,783,751。

1.2.3 体外抗肿瘤活性测试 采用MTT法分别对4个新型目标合物1～4进行人肺腺癌A549细胞和人源肝癌HepG2细胞(两种细胞由遵义医学院医学研究中心提供)的体外抗肿瘤活性检测[15-17]。

取对数生长期的肿瘤细胞，细胞悬浮液为含10%胎牛血清、双抗(青霉素 100 U/mL，链霉素100 μg/mL)的DMEM培养基(A549)和RPMI 1640培养基(HepG2)，调整细胞浓度为5×104个/mL 加于 96 孔板中，100 μL/孔。于5% CO2，37 ℃条件下培养 24 h。用培养基稀释由DMSO配制的目标化合物母液，再分别加入目标化合物孔中，使得目标化合物组最终浓度分别为5、10、20、40、60、80、100和120 μg/L。其他各设置孔补加 100 μL 培养基，孵育24 h后，小心洗去孔内液体，每孔加入 MTT 溶液 10 μL (5 mg/mL)及90 μL 培养基，37 ℃孵育 4 h后，小心吸去孔内液体， 加DMSO 100 μL/孔， 室温振摇5 min，用酶联免疫检测仪测490 nm OD值。根据细胞增殖抑制率公式计算：抑制率=1-[OD(目标化合物)-OD(空白)]/[(OD细胞对照-OD空白)]×100%[15-17]。 IC50值用统计软件 SPSS 17.0 进行计算。

2 结果

2.1 目标化合物的物理性质 以较高产率成功合成得到的4个目标化合物为黄色或橙黄色粉末状固体，熔点在164～181 ℃之间，均能溶解于二甲基亚砜、乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂中。

2.2 目标化合物的体外抗肿瘤活性 利用MTT法初步考察了目标化合物1～4对A549(人肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞)的体外抗肿瘤活性(见表1)。结果表明，目标化合物1和2对受试的两株细胞均表现出了优于美法仑的细胞毒性，而化合物1、2和3均表现出对人源肝癌细胞的细胞毒性，且优于美法仑，值得进一步对其进行更为深入的研究。此外，从表中数据结合目标化合物的分子结构还可以得出：随着二胺柔性链的增加对受试的两株细胞毒性减弱，而芳环二胺形成的化合物4却对受试的两株细胞均不敏感。

表1 化合物1～4的体外抗肿瘤活性

化合物IC50(μmol)A549HeGP21388523532482031263>10041644>100>100美法仑>1005310

2.3 化合物3的合成条件探索 目标化合物的低碳绿色合成是化学药物首要解决问题。为此，本文考察了目标化合物3的合成条件。

2.3.1 不同溶剂下反应温度对合成化合物3的影响 在反应原料物质的量比为1∶2[1,4-丁二胺∶4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛]下，考察了不同溶剂在不同反应时间对生成化合物3的影响，由结果(见表2)可知，在温度为80 ℃下反应2 h，以乙醇为溶剂所得产率最高，且乙醇对环境污染小，故对目标化合物3的合成以乙醇为溶剂反应2 h为最佳条件。

表2 溶剂和反应温度对化合物3产率的影响(%)

溶剂反应条件0℃，12h25℃，6h80℃，2h乙醇750287159728甲醇688271007385甲苯6032829882221，4二氧六环675669107678

2.3.2 物料比(物质的量比)对生成化合物3的影响 在温度为80 ℃下反应2 h，以乙醇为溶剂考察了不同物料比对生成化合物3的影响，结果(见表3)表明，在温度为80 ℃下反应2 h，以乙醇为溶剂下以物质的量之比为1∶2时产率最高。

表3 物料对化合物3产率的影响(%)

物质的量之比[1，4-丁二胺∶4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛]产率1∶173261∶297281∶259045

综上，目标化合物3的最佳合成条件：以乙醇做溶剂，1,4-丁二胺与4-二(2-氯乙基)氨基-2-羟基苯甲醛投料比(摩尔比)为1∶2，于80 ℃条件下回流反应2 h。

3 讨论

3.1 目标化合物的结构表征 在目标化合物1-4的1H NMR谱中，13.63～13.82 ppm范围内发现了酚羟基的质子化学位移，8.27～8.29 ppm范围内发现了席夫碱的特征CH=N质子化学位移，这证实了席夫碱结构的生成[8-9]。同时，芳环质子的化学位移在6.03～7.16 ppm之间出现。而氮芥亚甲基质子化学位移在3.7 ppm附近出现。在化合物1～4中，二胺的亚甲基质子化学位移在3.5～3.7 ppm之间出现，而化合物4中丁二胺中间2个亚甲基质子化学位移在1.63 ppm出现，化合物2的亚甲基化学位移出现在2.02 ～2.04 ppm，叔碳质子化学位移在1.22～1.25 ppm处，而甲基质子化学位移在1.33 ppm处，这些化学位移的积分均与预期结构相吻合。而在目标化合物的13C NMR谱中，在102～165 ppm之间出现了芳环碳信号，而在98 ppm附近均出现了席夫碱的特征CH=N碳信号[10-11]，其余亚甲基或甲基在28～58 ppm之间出现。

在4个目标化合物的HRMS谱中，实测的准分子离子峰与理论计算值在5‰范围之内，这进一步印证了目标化合物的分子结构。

而在4个目标化合物的FT-IR谱中，在3 447 cm-1附近出现了羟基特征振动吸收峰，而在2 941～2 862 cm-1出现了亚甲基或甲基的特征振动吸收峰。更为重要的是在1 608～1 619 cm-1出现了席夫碱的CH=N特征振动吸收峰[8-11]，与核磁结果相呼应。综上结构表征表明，本试验成功得到了预期的目标结构。

3.2 目标化合物的抗肿瘤活性 利用MTT法考察目标化合物1～4对A549(人肺腺癌细胞)和HepG2(人源肝癌细胞)的体外抗肿瘤活性的结果表明：目标化合物1和2对受试的两株细胞均表现出了优于美法仑的细胞毒性，而化合物1、2和3均表现出对人源肝癌细胞的细胞毒性。二胺柔性链的增加降低了对受试细胞的细胞毒性，而芳环二胺使其对受试细胞株不敏感，这可能是由于芳环的引入使氮原子上的孤对电子和芳环产生共轭作用，减弱分子结构中氮原子的碱性，进而使活性减弱。此外，柔性链的增加不利于化合物体外活性，与苯丁酸氮芥中载体部分羧基和芳环之间3个碳原子数活性最好具有类似性。这为后续设计含氮芥的新席夫碱化合物进行抗肿瘤活性研究提供了一定参考。

综上所述，本文通过将氮芥偶合于芳香醛，进一步通过羰基与伯胺的缩合成功设计合成4个新的含氮芥的席夫碱化合物，经MTT法测定目标化合物对A549(人肺腺癌细胞)和 HepG2(人源肝癌细胞)的体外抗肿瘤活性表明化合物1和2具有一定的抗肿瘤活性，值得进一步研究。

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收稿2016-09-25;修回2016-11-20

(编辑：王静)

Synthesis and antitumor activity of novel Schiff base bearing nitrogen mustard derivatives

ZhengWei,SongWenting,CaoYaping,YuanFumin,YuanZeli

(Department of Inorganic Chemistry,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To synthesize novel Schiff base bearing nitrogen mustard derivatives and theirinvitroantitumor activities were evaluated.Methods A serial of novel Schiff base bearing nitrogen mustard derivatives(1-4)were synthesized,and characterized by1H NMR,13C NMR,H RMS and FT-IR spectra.Meanwhile,The favorable reaction conditions of preparing the title compound 3 were found as follows:the reacting time was about 2 h,the reacting temperature was 80 ℃,the mol ratio of 1,4-diaminobutane to 4-[bis (2-chloroethyl) amino]-2-hydroxy -benzaldehyde was 1 to 2,and the solvent was ethanol.Theinvitroanticancer activities of 1-4 against A-549 and HepG2 cells were also tested by the MTT reduction assay.Results Four new amino acid Schiff base oxovanadium (IV) compounds 1-3 have been synthesized.The results discovered that compounds 1 and 2 have considerable cytotoxicity to both cancer cell lines,which were comparable to those of melphalan.Meanwhile,in contrast to the melphalan,compounds 1,2 and 3 have remarkable cytotoxicity to HepG2 cancer cell line.Conclusion Compounds 1 and 2 have potential benefits to against A-549 and HeGp2 cancer cells,which deserves further investigation.

Schiff base;nitrogen mustard;synthesis;antitumor activity

国家自然科学基金资助项目(NO：81660575、81360471)；贵州省国际合作项目(NO：127036)；贵州省卫生计生委科学技术基金资助项目(NO：gzwjkj2015-1-001)。

袁泽利, 男，博士, 教授, 硕士生导师, 研究方向：药物设计合成及性能研究，E-mail:zlyuan2002@126.com。

O622；R914.5

A

1000-2715(2016)06-0547-05