抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达

李晓倩，曹广如，王英全，王 苗，敖 骏，蔡玉强，岳昌武,3

(1.遵义医学院 贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 脊柱外科，贵州 遵义 563099; 3.遵义医学院第三附属医院 中心实验室，贵州 遵义 563002)

基础医学研究

抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗的构建与表达

李晓倩1，曹广如2，王英全1，王 苗1，敖 骏2，蔡玉强2，岳昌武1,3

(1.遵义医学院 贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院附属医院 脊柱外科，贵州 遵义 563099; 3.遵义医学院第三附属医院 中心实验室，贵州 遵义 563002)

目的 构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗。方法 利用DNA重组技术，将激活细胞免疫和体液免疫的MPT64/Ag85B优势抗原基因和野生型katG基因编码区以及穿孔素/颗粒溶素整合进串联真核表达载体pIRES2-EGFP中，构建抗结核重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1；电转化方法将质粒重组耻垢分枝杆菌制备菌苗；通过脂质体Lipofectamine 2000介导将重组质粒转染293T细胞。应用qRT-PCR 技术在mRNA水平检测靶基因体外表达效果并用Western blot方法检测转染细胞是否表达目的蛋白。结果 PCR证实重组质粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1构建成功并制备重组耻垢分枝杆菌菌苗；qRT-PCR分析表明重组质粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRF1基因转染293T细胞后均有表达，免疫印迹分析重组质粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相对分子质量72 kDa处有明显蛋白表达条带，且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达；融合蛋白GNLY/PRF在相对分子质量75 kDa处有明显蛋白表达条带。结论 成功构建抗结核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重组质粒DNA疫苗，为进一步研究该疫苗的免疫作用提供依据。

耻垢分枝杆菌；疫苗；耐药结核分枝杆菌；多价疫苗；表达分析

结核病 (tuberculosis,TB)由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB) 引起的慢性传染病，是目前危害人类健康的主要疾病[1]。WHO估计全世界已有约20亿人感染结核病，其中受耐药菌株感染者可能达到5 000万，每年新发患者约940万， 每年死亡人数高达200万，在所有传染病中TB死亡率仅次于AIDS[2]。结核病的高耐药率和耐药结核分枝杆菌的不断流行与传播已成为全球结核病防控工作中最为棘手的问题[3-4]。卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)仍是预防结核病的有效疫苗，但其免疫保护效果从0至80%不等，尤其是对成年人的预防效果不佳[5-6]，因此，开发安全有效的新型疫苗势在必行。结核分枝杆菌中有多种分泌蛋白，如Ag85复合物和MPT64分泌蛋白，尤其是Ag85B和MPT64蛋白能够引起结核分枝杆菌感染者强烈的Th1型免疫反应，具有较强的免疫原性。近年来Ag85A、Ag85B等优势抗原基因被用于DNA疫苗、重组 BCG 疫苗、纳米疫苗等多种形式的结核病预防研究中，且被证实具有很好的免疫保护效果[7-8]。Ag85A、Ag85B、MPT64等抗原基因单独或联合免疫都具有一定的诱导机体产生体液免疫或细胞免疫的活性，且多基因联合免疫则表现出更好的免疫效果[9]。颗粒溶素(granulysin,GNLY)是一种天然的抗菌肽，与穿孔素(perforin,PRF1)共同定位于人的细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK)颗粒中，具有抗病原微生物、抗肿瘤等多种生物活性。而穿孔素可在靶细胞膜上形成多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏。穿孔素还可使一些颗粒分子如颗粒溶素进入靶细胞内，对胞内感染发挥免疫作用。研究证实颗粒溶素在体外72 h内可直接杀死90%以上的结核分枝杆菌[10]，两者均对结核病具有保护性免疫作用[11-12]。本研究利用基因工程技术构建重组质粒MPT64/Ag85B:katG:GNLY/PRF1串联真核表达质粒，并在293T细胞检测到目的基因和蛋白的表达，为后续用于小鼠结核病的治疗实验提供理论和实践依据，为新型抗结核疫苗的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株、菌株和载体 人源胚胎肾293T细胞由医学与生物学研究中心口腔实验室刘建国教授课题组惠赠、载体pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(+)由本课题组保存、大肠杆菌基因工程菌JM109购自博迈德生物科技公司，耻垢分枝杆菌(CGMCC1.0562)购自中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂与主要仪器 总RNA提取试剂盒(RNAiso Plus*)、逆转录试剂盒、限制性内切酶(宝生物大连公司)；DL2000 DNA maker、高纯质粒小量抽提试剂盒(博迈德北京生物科技公司)；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物工程上海有限公司)；Lipofectamine2000转染试剂盒购自(invitrogen美国公司)；Hyclone DMEM培养基、青链霉素、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、TBS(索莱宝北京有限公司)；兔抗结核分枝杆菌Ag85B，兔抗结核分枝杆菌MPT64(abcam英国公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(碧云天生物技术江苏公司)。

Clinx Chemi Scope5000系列一体式化学发光仪器(上海勤翔科学仪器有限公司)。SYBR®PrimeScript TM RT PCR KitⅡ(Takara)；MINI Trans-Blot电转化仪( Bio-Rad)，CFX96 荧光定量 PCR 仪(BIO-RAD)；超净台(SW-CJ-2FD)苏州净化设备有限公司；全自动凝胶成像分析系统(SYNGENE)。采用 Primer Premier5 软件设计引物，引物合成及目的基因测序由英潍捷基(广州)有限公司完成，唯尚立德(北京)生物科技有限公司完成全基因合成。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建 课题组前期以耻垢分枝杆菌基因组DNA为模板，克隆分枝杆菌复制起始点oriM，构建质粒pcDNA3.1-OriM，以结核分枝杆菌基因组DNA为模板，克隆katG和MPT64、Ag85B基因，分别构建质粒pcDNA3.1-katG、pcDNA3.1-MPT64/Ag85B；以人cDNA为模板，克隆GNLY、PRF1编码基因，构建质粒pcDNA3.1-GNLY/PRF1。具体方法如下：①NotI、XbaI酶切pcDNA3.1-OriM和pIRES2-EGFP质粒，分别出现2.1 kb、5.4 kb和5.2 kb条带，切胶回收2.1 kb条带与5.2 kb连接，构建pIRES2-EGFP-OriM；②NheI、BglII酶切pcDNA3.1-katG和pIRES2 EGFP-OriM质粒，分别出现2.2 kb、5.4 kb和7.4 kb条带，切胶回收2.2 kb条带与7.4 kb连接；构建pIRES2-EGFP-OriM-katG；③XhoI、EcoRI酶切pcDNA3.1-MPT64/Ag85B和pIRES2 EGFP-OriM-katG质粒，分别出现2.3 kb、5.4 kb和9.6 kb条带，切胶回收2.3 kb条带与9.6 kb连接，构建pIEMKMA；④EcoRI、PstI酶切pcDNA3.1-GNLY/PRF1和pIEMKMA质粒，分别出现2.5 kb、5.4 kb 和12 kb条带，切胶回收2.5 kb与12 kb连接构建定向表达的多基因串联表达质粒载体pIEMKMAGP。

1.2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建

1.2.2.1 电转化 取质粒，溶于无菌水中，调整质粒浓度为1 μg/μL；取5 μL质粒DNA和400 μL耻垢分枝杆菌感受态细菌置于0.2 cm直径的穿孔杯(预冷)中轻轻混匀；冰浴10 min后，电转化耻垢分枝杆菌(电穿孔参数为：电压2.5 kV、电容25 μF、电阻1 000 Ω)；电穿孔后，立即冰浴10 min，将细胞迅速加入5 mL的LB液体培养基，37 ℃振荡培养3 h；将上述菌液(200 μL)涂布于含 300 μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选，室温静置至水分渗入培养基中，封口膜封闭平板，倒置于37 ℃培养箱中培养。3～4 d后，可见白色干燥的单个菌落。

1.2.2.2 菌液PCR进行基因型鉴定 挑取单菌落分别接种于5 mL含500 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37 ℃振荡培养3～4 d；取1 mL菌液，离心弃上清，沉淀加入0.5 mL三蒸水，100 ℃加热裂解8 min；取上清2 μL菌液进行PCR，鉴定筛选阳性克隆；以转化菌的单克隆为模板，通过特异性引物进行PCR，将扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测，若PCR 产物片段大小与目的片段大小一致，则证明转化成功。

1.2.2.3 制备菌苗 挑取LB固体培养基上阳性克隆重组菌落，以0.05%吐温盐水充分研磨后，接种LB液体培养基，37 ℃振摇培养约3 d后，离心弃上清；以高压灭菌的0.9%生理盐水反复淘洗后自然沉淀3次，每次10 min，取上清，弃沉淀；分别以完全DMEM培养液重新调整细菌浓度2×107CFU/L，即得菌苗。

1.2.3 293T细胞转染 实验共分3组，C为空白对照组：用含10%的新生牛血清DMEM(高糖)培养基常规培养细胞；B为载体对照组：载体PIRES2-EGFP转染细胞；A为实验组：质粒转染细胞。各组细胞(细胞密度为1×105/mL)均接种于6孔板，每组设3个复孔，细胞种板24 h后进行转染实验，转染步骤按照LipofectinTM2 000说明书要求进行。

1.2.4 Real-Time RT-PCR 总RNA提取：按照RNAiso Plus*试剂说明书进行总RNA的提取。取1 000 ng RNA利用宝生物PrimescriptTMRT reagent kit (DRR037A)，采用20 μL PCR体系反转录条件如下：37 ℃温育15 min，然后 85 ℃加热5 s (失活反转录酶)。以反转录后的cDNA品为模板，分别扩增katG、Ag85B/MPT64和GAPDH基因。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共进行40个循环；从55 ℃开始，每0.5 ℃采集1次荧光，每次10 s，共采集81次确定熔解曲线。荧光定量PCR引物序列(见表1)。

表1 荧光定量PCR引物及序列

基因引物名称引物序列产物长度(bp)katGKatG-FP5＇-GATGGGGCTGATCTACGTGA-3＇151KatG-RP5＇-CTTACCGAAAGTGTGACCGC-3＇Ag85B/MPT64Ag85B/mpt64-FP5＇-CAATGATCTTGGCCGCCTAC-3＇211Ag85B/mpt64-RP5＇-CCCGCAATAAACCCATAGCC-3＇GNLY/PRF1GNLY/PRF1-FP5＇-CCCAGAAGGTACCCCATTGT-3＇232GNLY/PRF1-RP5＇-CACTTCTCTGGGTGGGCTTA-3＇GAPDHGAPDH-FP5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3＇186GAPDH-RP5＇-TGATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3＇

1.2.5 Western blot检测转染后蛋白表达 培养293T细胞并于转染48、60 h收集细胞，RIPA裂解液提取蛋白，并用丙酮沉淀的方法浓缩上清蛋白，BCA法测定蛋白含量，分装冷冻保存。Western blot鉴定：上样(20 μg)，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜(350 mA，2 h)。封闭[5%(w/v)脱脂奶粉，2 h]，一抗(兔抗结核分枝杆菌Ag85B，1∶5 000、兔抗结核分枝杆菌MPT64，1∶1 000)4 ℃过夜，PVDF膜用TBST洗膜6次，5 min/次，二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG)室温孵育2 h，ECL发光试剂工作液进行蛋白信号检测，Clinx Chemi Scope 5000系列一体式化学发光仪器曝光拍照分析。

2 结果

2.1 质粒构建 质粒pcDNA3.1-oriM、pcDNA3.1-katG、pcDNA3.1-MPT64/Ag85B、pcDNA3.1-GNLY/PRF1前期构建成功。NotI、XbaI酶切pcDNA3.1-oriM，出现2.1 kb和5.4 kb 大小的2个目的条带(见图1A)，切胶回收2.1 kb条带；NotI和XbaI酶切pIRES2-EGFP质粒出现唯一条带5.2 Kb，与pcDNA3.1-oriM酶切产物2.1 Kb相连，命名pIRES2-EGFP-ORIM。NheI、BglII酶切pcDNA3.1-katG，出现2.2 kb和5.4 kb 2条带(见图1B)，切胶回收2.2 Kb条带；NheI、BglII酶切pIRES2-EGFP-ORIM质粒，出现唯一条带7.4 Kb，与pcDNA3.1-katG酶切产物2.2 Kb相连，命名pIRES2-EGFP-ORIM-katG。XhoI、EcoR I酶切pcDNA3.1-MPT64/Ag85B，出现2.3 Kb和5.4 Kb 2条带(见图1C)，切胶回收2.3 Kb条带；XhoI、EcoR I酶切pIRES2-EGFP-ORIM-katG，出现唯一条带9.6 Kb，与pcDNA3.1-MPT64/Ag85B酶切产物2.3 kb相连，命名pIEMKMA，EcoRI、PstI酶切pIEMKMA质粒，出现唯一的条带12 Kb，与pcDNA3.1-GNLY/PRF1酶切产物2.5 kb相连(见图1D)，并测序验证结果表明，成功构建目标质粒pIEMKMAGP(见图2)。

A图中，M：Marker(DL10 000)；1：pcDNA3.1-oriM 酶切片段(NotI/XbaI)。B图中，M：DNA Marker DL5 000；2：pcDNA3.1-katG 酶切片段(NheI/BglII)。C图中，M：DNA Marker DL5 000；3：pcDNA3.1-MPT64/Ag85B 酶切片段(XhoI/EcoRI)。D图中，M：Marker (DL10 000)；4：pcDNA3.1-GNLY/PRF1 酶切片段(EcoRI/PstI)。图1 pIRES2-EGFP-ORIM-katG-MPT64/Ag85B:GNLY/PRF1(pIEMKMAGP)质粒酶切结果

图2 pIRES2-EGFP-ORIM-katG-MPT64/Ag85B:GNLY/PRF1(pIEMKMAGP)质粒图谱

2.2 重组耻垢分枝杆菌菌苗的构建 制备耻垢分枝杆菌感受态细菌，通过电转化将构建的DNA疫苗pIEMKMAGP转化耻垢分枝杆菌，通过抗性筛选，获得转化子。质粒pIEMKMAGP成功电转化重组耻垢分枝杆菌，菌落PCR扩增结果：分别用引物对oriM、katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1编码基因扩增，分别在1 500 bp、1 500 bp、1 800 bp、1 800 bp处见到特异性目标条带，与理论值大小相符(见图3)，引物序列见表2。

2.3 质粒转染293T细胞结果效果分析 质粒转染293T细胞48 h后在荧光显微镜下均可观察到绿色荧光产生(见图4)，空白对照组均未见荧光蛋白表达，表明目标质粒成功转染靶细胞，且插入基因系统可以成功表达。

M：DNA DL2 000分子量标准；1：orim PCR的扩增片段；2：katG PCR的扩增片段；3：mpt64-ag85b PCR的扩增片段；4：颗粒溶素-穿孔素 PCR的扩增片段；5：orim的阴性对照；6：katG的阴性对照；7：mpt64-ag85b的阴性对照；8：颗粒溶素-穿孔素的阴性对照。 图3 质粒pIEMKMAGP电转化重组耻垢分枝杆菌菌落PCR鉴定

表2 PCR引物及序列

基因引物名称引物序列产物长度(bp)oriMF5＇-GCACCCAGTCCGCCCTGAGC-3＇1500R5＇-CAAACCTGCTGGTCGTGGAC-3＇katGF5＇-GAACGGCAACCCGGACCCCAT-3＇1500R5＇-AACGCACACCGGCCTTATTC-3＇Ag85B/MPT64F5＇-GGCGCTTGTCGAGGTCTATG-3＇1800R5＇-ACTATCGACAGTCCCGACTG-3＇IRES/GNLY/PRF1F5＇-TCCCGCCCAACGGCACGCAC-3＇1800R5＇-GAGGTGTGATGGCCGCCAAC-3＇

A、B分别是PIRES2-EGFP载体、质粒pIEMKMAGP转染293T细胞自然光视野图，D、E分别是 PIRES2-EGFP载体、质粒pIEMKMAGP转染293T细胞荧光视野图，C、F均为空白细胞对照。图4 质粒转染293T细胞结果(×200)

2.4 质粒转染人源胚肾293T细胞中靶基因在mRNA水平上表达 利用定量PCR分析技术对质粒pIEMKMAGP成功转染的293T细胞中靶基因katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1的mRNA表达水平进行了检测(见表3和图5)，结果表明：实验组与空白对照组和载体组分别比较，靶基因katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1表达水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，提示katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1融合基因在293T细胞内在mRNA水平上成功表达。

基因组别Ct△Ct△△Ct2-△△CtMPT64/Ag85BA1545±070-089±017∗#-497±0515780±084B2033±042397±096-045±021460±070C2127±043400±038——katGA1622±043-012±009∗#-564±0674870±160B2212±070580±071068±041081±020C2185±076550±064——GNLY/PRFA1581±024-054±027∗#-477±0353890±201B1978±015343±079-057±079250±281C2035±032400±041——GAPDH1661±021———

与空白对照组相比，*P<0.05；与载体对照组相比，#P<0.05。

与空白对照组比较，*P<0.05；与载体对照组比较，#P<0.05。 图5 质粒pIEMKMAGP转染293T细胞检测katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1基因在mRNA水平上表达情况

2.5 Western blot检测转染后蛋白表达情况 Western blot鉴定结果显示，质粒转染组的总蛋白和上清蛋白Western blot 鉴定均可见到融合蛋白MPT64/Ag85B大小为72 kDa左右的条带(见图6B、C)，并可见融合蛋白GNLY/PRF1大小为75 kDa左右的条带(见图6D)，表明融合基因MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1在293T细胞内成功表达，且检测到融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表达。

A：β-actin; B：胞浆蛋白MPT64/Ag85B检测；C：分泌蛋白MPT64/Ag85B检测；D:胞浆蛋白GNLY/PRF1检测；1：转染48 h；2：空载体对照；3：转染60 h；4：空载体对照；5:空白对照。 图6 质粒pIEMKMAGP转染293T细胞检测MPT64/Ag85B和GNLY/PRF1基因在蛋白水平上表达情况

3 讨论

近年来，随着感染多重耐药结核菌的患者大量出现，国内外的新型疫苗和增强卡介苗研究工作日益受到重视，候选疫苗筛选和新型抗结核疫苗的研究迫在眉睫[13-14]。目前，临床上尚缺乏对耐药结核及肺癌同时具有预防和治疗作用的药物或多价基因工程菌苗。基因工程疫苗或菌苗可能是今后耐药结核疫苗研究的一个重要方向，如何做到对绝大部分耐药结核都具有预防和治疗作用，是新型疫苗创制过程中应关注的关键问题之一。机体对结核杆菌虽能产生抗体，但无保护作用，其抗感染主要依赖细胞免疫。Ag85B是Ag85复合体的组成部分，Ag85b和mpt64可诱导TH1型免疫应答，是结核分支杆菌的保护性抗原[15]。穿孔素与对结核杆菌的拮抗能力有着密切联系，主要机制是由于CD8+T细胞促使穿孔素等具有溶解感染细胞进而使得内源性的DNA内切酶被激活使得细胞凋亡增强。研究证实颗粒溶解具有很强的抗结核杆菌活性，颗粒溶素是一种天然的抗菌肽，它是评价机体细胞免疫功能状态的新指标，结核病患者体内颗粒溶素的产生受到选择性抑制，成功治疗后则持续回升[16]。颗粒溶素不仅可以直接杀伤胞外结核杆菌，而且在穿孔素的协同作用下也可杀伤胞内结核菌。有研究表明，穿孔素和颗粒溶素在肺结核患者发生病变部位的表达水平明显低于正常组织[17-18]。穿孔素和颗粒溶素对结核分枝杆菌杀伤作用表明穿孔素、颗粒溶素可以用作人结核免疫性保护的标记，并可用来研究更多有效的结核疫苗[19]。

本研究选取能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的结核分枝杆菌优势抗原Ag85B和MPT64编码基因、对结核分枝杆菌有杀伤作用的穿孔素与颗粒溶素编码基因，以及katG编码基因整合到改造后的适合多基因串联表达的真核表达质粒载体中，并成功转化和结核分枝杆菌具有相同属特异性抗原的人正常菌株耻垢分枝杆菌体内制成菌苗，成功构建了可能在细胞、体液免疫水平、和颗粒溶素与穿孔素生物治疗作用及katG辅助异烟肼化疗的多效DNA疫苗。本研究所用的靶基因均为功能已知基因，其功能已经确证。且DNA疫苗涉及的各个片段除katG未做成基因疫苗外，其他片段分别前人做成单独或组合DNA疫苗并被证明有功能。本课题结合靶向结核分枝杆菌穿孔素、表面抗原决定簇抗体、颗粒溶素融合蛋白、异烟肼活化酶真核表达等多个层次综合杀灭耐药结核分枝杆菌，利用耻垢分枝杆菌等减毒生物体载体开发费用低廉、靶向性好、实用性强的新型治疗性活疫苗。并且重组质粒转染293T细胞检测融合蛋白MPT64/Ag85B和GNLY/PRF1成功表达，为进一步研究该疫苗的免疫效果奠定基础。

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[收稿2016-09-12;修回2016-11-02]

(编辑：王静)

Construction and expression of a plasmid DNA vaccine MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 againstMycobacteriumtuberculosis

LiXiaoqian1,CaoGuangru2,WangYingquan1,WangMiao1,AoJun2,CaiYuqiang2,YueChangwu1,3

(1.Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources & Drug Development,Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Spinal Surgery,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Key Laboratory,Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563002,China)

Objective Construction and expression of a plasmid DNA vaccine MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 againstMycobacteriumtuberculosis.Methods A polyvalent DNA vaccine was constructed by integrated the artificially fused gene with the coding regions of Ag85B/MPT64,GNLY/PRF1 and the coding region of kat G into pIRES2-EGFP.After the vaccine was transfected into 293T cells mediated with lipofectamine 2000 for 48 h,the protein was examined by Western blotting techniques.ResultsMPT64/Ag85B,GNLY/PRF1andkatGgenesweresuccessfullyamplifiedbyPCR.TheresultsofWesternblottingdemonstratedthattheproteinwasexpressedin293TcellsandfusionproteinMPT64/AG85Bwasexpressed.Conclusion MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 vaccine ofMycobacteriumtuberculosiswas constructed,which may the provide basis for development of new anti-tuberculosis vaccine.

Mycobacteriumsmegmatis; vaccine; drug-resistantMycobacteriumtuberculosis; multipartial vaccine; expression analysis

贵州省科技厅社发攻关项目(NO：黔科合SY字2015[3036])；遵义医学院基础-临床合作项目(NO：F-688)。

岳昌武，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向：精准医学与新药创制，E-mail:changwuyue@126.com。

R186

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1000-2715(2016)06-0577-07