3种斑蝥素碱土金属盐类衍生物对HepG2人肝癌细胞生长的抑制作用

惠 景，李晓飞，朱欣婷，姜胜男，晏 容，范 芳，刘 云

(1.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 基础医学院生化教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

3种斑蝥素碱土金属盐类衍生物对HepG2人肝癌细胞生长的抑制作用

惠 景1,2，李晓飞1,2，朱欣婷1,2，姜胜男2，晏 容1,2，范 芳1,2，刘 云1

(1.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 基础医学院生化教研室，贵州 遵义 563099)

目的 比较3种斑蝥素碱土金属盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2的抑制增殖及促凋亡作用。方法 采用3种斑蝥素盐类衍生物分别对体外培养的肝癌细胞HepG2进行干预，磺酰罗丹明染色法(SRB 法)检测细胞增殖抑制作用；相差显微镜结合Hoechst33342染色观察细胞形态学变化；流式细胞技术检测细胞凋亡。结果 3种斑蝥素盐类衍生物均呈浓度依赖性抑制人肝癌细胞HepG2的生长，尤以斑蝥素酸镁的抑制效应最强(P<0.05)；斑蝥素酸镁对人肝癌细胞HepG2的形态影响比斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶明显；Hoechst 33342染色显示斑蝥素酸镁致HepG2细胞出现凋亡细胞形态特征比斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶明显；流式细胞术检测结果表明，同一浓度3 μg/mL的斑蝥素酸镁的促进凋亡作用明显高于斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶(P<0.05)。结论 3种斑蝥素盐类衍生物均具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸镁的作用明显强于斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶。

斑蝥素酸镁；斑蝥素酸钙；斑蝥素酸锶；人肝癌细胞HepG2；抗肿瘤

斑蝥素(Cantharidin)是芫菁科昆虫体内产生的活性物质，研究表明它能够治疗多种癌症，包括肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、口腔鳞状细胞癌和结肠癌等[1-3]。本课题组前期研究也表明斑蝥素类物质能通过干预肿瘤细胞周期的变化，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的[4]。作为临床化疗药物，其最大优点是不会降低癌症患者体内的白细胞数量水平，对于肝癌的治疗效果最为明显[5]。但是，斑蝥素会对泌尿系统和肾脏带来毒副作用。因此，目前该领域的研究热点是：开发一系列具有抑癌作用的 斑蝥素衍生物，使其在保留治疗效果的同时，能最大限度的降低生物毒性[6-7]。

本课题组前期工作以斑蝥素为原料合成了多种斑蝥素盐类衍生物，包括斑蝥素酸钠、斑蝥素酸镁和斑蝥素酸钾等，并对其抗癌活性做了报道[8-9]；研究发现镁元素与斑蝥素相结合后，能显著提升斑蝥素的活性，改善其水溶性。镁元素为第二主族第三周期的元素，在这个主族中，镁(Mg)和钙(Ca)都是人类所需矿物质的常量元素，在作为酶的激活剂和保持神经肌肉兴奋性等方面具有重要作用，是维持生命代谢不可替代的重要元素[10-12]。该主族的锶(Si)元素作为人体所需的微量元素能防止脑血栓形成[13]和骨质的流失[14]。而在第二主族元素中铍、钡、镭的摄取会对人体造成伤害。因此，本研究选择合成了斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶3种斑蝥素的盐类衍生物，拟考察与镁元素处于同一主族的其它金属元素(如钙、锶)与斑蝥素结合后的抗癌活性差异，为进一步评价此类衍生物的不同抗癌应用前景奠定实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 斑蝥素酸镁由自制斑蝥素合成，制备方法已授权国家发明专利[15]，斑蝥素酸钙、斑蝥素酸锶的合成方法参考斑蝥素酸镁完成。细胞实验前，先用去离子水将上述3种衍生物分别配置成1.2 mg/mL的母液备用。

1.1.2 肝癌细胞株 人肝癌细胞HepG2购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.1.3 试剂 磺酰罗丹明(SRB)购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养基、南美胎牛血清和胰蛋白酶购自美国HYCLONE公司；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、Hoechst33342染液为碧云天生物技术有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 3131型CO2培养箱和Multiskanspectrum全波长酶标仪购于美国Thermo公司；NikonYS100显微镜购于日本Nikon公司；FACS Calibur流式细胞仪购于美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞的培养 人肝癌HepG2细胞采用RPMI-1640培养基(含10%的南美胎牛血清)在37 ℃、5% CO2和60%的湿度下培养。待细胞生长融合度至80%～90%时，弃去培养液，PBS冲洗2～3遍，用0.25%胰蛋白酶消化后，加培养液吹打均匀，于CO2培养箱中继续传代培养。本研究共分为4个组：分别为对照组，斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙、斑蝥素酸锶干预组，给药方式为将药物配置成对应浓度的母液再直接混合到培养基中。

1.2.3 人肝癌细胞HepG2形态变化 接种100 μL细胞于96孔板中(8 000 个细胞)，37 ℃、5% CO2和60%的湿度下培养20 h后，再加入斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶，终浓度为3 μg/mL，对照组加100 μL培养基，每组设3个平行孔，培养48 h后，通过普通光学显微镜观察HepG2细胞形态变化。然后PBS洗1遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，弃固定液，PBS洗1遍，加Hoechst 33342染色液100 μL避光染色25 min，荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学特征。

1.2.4 流式细胞技术检测细胞凋亡 接种1 mL细胞于6孔板中(2×105个细胞)，37 ℃、5% CO2和60%的湿度下培养20 h后，加入斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶，药物终浓度均为3 μg/mL。实验设3个重复，同时设置空白对照组。将培养瓶放入37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养24 h后，根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 3种斑蝥素盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用 由图1可知，3种斑蝥素盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2的增殖都具有抑制作用。在给药24 h后，其受试物在浓度0.375～6.000 μg/mL范围内抑制作用随浓度增加而增加，量效关系明显。其中斑蝥素酸镁的抑制肝癌细胞的活性明显好于斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶(P<0.05)。

A：作用时间24 h；B：作用时间48 h；C：作用时间72 h。图1 3种斑蝥素盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用

2.2 3种斑蝥素盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2形态的影响 如图2所示，3 μg/mL的斑蝥素酸镁作用于人肝癌细胞HepG2 48 h后，细胞数量明显减少，细胞皱缩变圆，而相同浓度的斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶的抑制效果明显不如斑蝥素酸镁。经Hoechst 33342染色后，3 μg/mL斑蝥素酸镁作用于人肝癌细胞HepG2细胞24 h后，细胞数量减少，细胞核固缩、致密浓染呈蓝色，而相同浓度的斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶对人肝癌细胞HepG2的作用效果明显弱于斑蝥素酸镁。

A:空白对照组；B:斑蝥素酸镁；C：斑蝥素酸钙；D:斑蝥素酸锶。A1、B1、C1、D1为相差显微镜所见；A2、B2、C2、D2为Hoechst33342染色结果。图2 3种斑蝥素衍生物对人肝癌细胞HepG2形态的影响

2.3 3种斑蝥素盐类衍生物对人肝癌细胞HepG2的促凋亡作用 终浓度为3 μg/mL的斑蝥素酸镁、斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶分别作用于人肝癌细胞HepG2 24 h后，流式细胞术散点图检测显示早期凋亡细胞的存在(见图3)，其中斑蝥素酸镁促进肝癌HepG2细胞发生早期凋亡的能力明显强于斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶(P<0.05)。

A:空白对照组；B:斑蝥素酸镁；C：斑蝥素酸钙；D:斑蝥素酸锶。n=3,*：P<0.05。图3 流式细胞术检测3种斑蝥素盐类衍生物对肝癌细胞HepG2的促凋亡作用

3 讨论

斑蝥素是从我国珍贵传统中药斑蝥中提取的并已确定结构的抗癌药物，其具有良好的广谱抗肿瘤活性。目前，国内外研究人员通过改造斑蝥素结构，合成衍生物，研究其抗癌活性及机理。还有研究人员将斑蝥素与其它化疗药物或靶向物质联用，寻求更好的治疗癌症效果[16-19]。这些都说明斑蝥素具有极强的改造潜力、研究价值和发展前景[20-21]。

本实验研究结果显示，3种斑蝥素盐类衍生物均具有抑制人肝癌细胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸镁的作用明显强于斑蝥素酸钙和斑蝥素酸锶。从上述结果可以看出随着第二主族中原子半径的增加，斑蝥素相关盐类衍生物的抗肿瘤活性在降低。虽然镁、钙、锶都属于第二主族元素，但是就个体属性而言，镁元素的碱土性质明显低于钙元素和锶元素。此外，镁离子还是细胞中多种酶的辅助因子和激活剂，参与细胞分裂、生长、凋亡，在整个细胞周期中起着非常重要的作用。国内外研究人员发现摄入一定量的镁元素能降低化疗带来的副作用[22]，并且镁元素的摄入与肿瘤发生率之间呈现某种相关性[23]：比如长时间的跟踪调查显示镁元素的摄取会有利于初期胰腺癌的抑制[24]。通过对癌症患者体内微量元素的检测也证实正常人与患者体内镁元素含量有显著差异[25]：子宫肌瘤组织中的镁元素明显低于正常组织。这些研究表明镁元素与肿瘤的发生和发展具有某种潜在的关系，在斑蝥素的结构上引入镁元素后表现出的良好抗癌活性，有可能是斑蝥素和镁元素在抗癌方面的优势进行了叠加。另外，三种斑蝥素盐类衍生物的毒性还未评价，这些研究将后续跟进。课题组希望通过本研究，能为抗癌药物研究工作者在合成其他抗肿瘤盐类衍生物的时候，提供一点提示。

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收稿2016-10-02;修回2016-11-07〗

(编辑：王静)

The inhibitory effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on HepG2 Cells

HuiJing1,2,LiXiaofei1,2,ZhuXinting1,2,JiangShengnan1,2,YanRong1,2,FanFang1,2,LiuYun1

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry,Basic Medical College,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To test and compare the effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on inhibiting proliferation and promoting apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods Three cantharidate derivatives were added to HepG2 cells and cell growth inhibition was measured by the sulforhodamine B (SRB) assay.Morphological changes were observed through phase contrast microscope with Hoechst 33342 staining.Flow cytometry (FCM) was used to measure apoptosis of HepG2 cells.Results All the cantharidate derivatives could inhibit the proliferation of HepG2 cells concentration-dependently and magnesium cantharidate was the best(P<0.05).Magnesium cantharidate had the greatest influence on morphological changes of HepG2 cells among three derivatives.Hoechst 33342 staining indicated that the morphological changes caused by apoptosis of HepG2 cells was most obvious with magnesium cantharidate among three derivatives.Magnesium cantharidate had the greatest influence on promoting apoptosis of HepG2 cells among three cantharidate derivatives with the same concentration (3 μg/ml) (P<0.05).Conclusion All three cantharidate derivatives could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of HepG2 cells in vitro.In terms of the effects,magnesium cantharidate was the best.

magnesium cantharidate；calcium cantharidate；strontium cantharidate；hepatocellular carcinoma cells HepG2；anti-tumor

国家自然科学基金资助项目(NO：81560669，81260488)；贵州省科技合作计划项目(NO：黔科合LH字20157509，黔科合LH字2015〗7516)；贵州省卫计委科学技术基金资助项目(NO：gzwjk2015-1-013)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(NO：黔教合KY字2014〗212)。

刘云，男，博士，副教授，研究方向：小分子抗癌药物研究与开发，E-mail:liuyunzy@126.com。

R739.65

A

1000-2715(2016)06-0568-05