食品专业教学中聚合酶链式反应机理的教学技巧

韩颖颖 刘宝林 周国燕 李维杰

摘要：对于初学者或非生物专业学生来讲，聚合酶链式反应（PCR）的机理和指数扩增机理比较抽象而难以理解。本文就食品专业本科生和研究生教学中如何技巧性地讲授这一反应的机理进行了图文并茂有层次的阐述，包括问题的引入、复制的原理、指数扩增的依据以及如何在食品微生物检测中应用几个方面。

关键词：食品专业教学；聚合酶链式反应；教学技巧

中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）13-0194-02

聚合酶链式反应（PCR）是种在体外快速扩增特定DNA序列的方法，又称基因的体外扩增。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，通过两端的寡核苷酸引物确定其特异性。因PCR反应具有微观抽象的特点，所以对于包括食品专业学生在内的跨专业学生或初学者来讲理解起来有些难度，本文就如何技巧性地讲授PCR原理和应用进行探讨，以便为广大食品专业教师提供参考。

一、从食品科学中常见的问题入手

将食品与生物学相结合的连接点是食品微生物。所以在讲授中，先从食品微生物中常见问题入手，使学生有可以接受的切入点。

食品微生物研究中常遇到是微生物量的检测问题，包括益生菌是否达标，或有害微生物是否超标。但如何对这些微生物进行定量是长久以来关注的问题，比较常用的是菌落计数方法。但此方法处理较繁琐，且易受到操作和人为方面的影响。而PCR可以为菌落的定量提供更加精确的指标。通过这样的引入，学生可以带着问题去探讨PCR反应的机理。

二、从DNA复制原理入手讲授PCR的基本原理

在PCR基本原理讲授时要从学生较易理解的角度进行问题的探讨。首先为什么可以用PCR对微生物进行定量呢？首先要谈的是，每种生物细胞（核）内都有一种物质叫做基因或DNA。对微生物内DNA量的鉴定，就可反应某种微生物在食品中的量。

首先从DNA结构和复制讲起。DNA是双螺旋结构（如图1A），为便于理解PCR反应，可将DNA结构以平面结构方式展示（图1B）。从图1B可以看到，DNA两条链通过碱基配对以氢键结合在一起。其中腺嘌呤（A）—胸腺嘧啶（T）配对，鸟嘌呤（G）—胞嘧啶（C）配对。能够配对的碱基叫做互补碱基。

在生物细胞内，为实现细胞分裂，DNA每天都在进行着复制。DNA复制的起始是通过一段短的寡核苷酸引物引导进行的，尤其是反向复制的一条新链，必须有多条引物来引导（由于DNA的聚合须按照5到3的方向，在拓朴异构酶等将DNA双链打开后，以3到5方向为模板合成的单链可直接按照5‘到3‘的方向合成；另一条链以5‘到3‘方向的母链为模板，所以须按照5‘到3‘的方向合成一小段一小段的DNA，最后通过连接酶连接起来），遵循A—T、G—C互补原则，按照模板链的碱基顺序在新的链上添加核苷酸合成新的DNA链。

正是因为体内DNA复制的发现，1971年Khorana提出，如果体外有单链DNA、引物、dNTP和DNA聚合酶，那么在体外也可进行DNA复制反应。此设想很容易理解，但由于引物合成在当时比较困难，没有实验验证，应用需求也不明确，所以后来被人淡忘。

1983年引物合成技术已经成熟。Mullis是Cetus公司专门做DNA测序的研究人员，其正为测序时DNA模板浓度太低而发愁。在一个曲折回复的山路上行驶时，Mullis想到了体外DNA复制可扩大模版的量。

DNA复制需单链DNA模板，但DNA一般以双链形式存在。DNA单链在细胞内的形成靠异构酶等来完成，而在体外可通过加热使其变性的方法进行。Mullis的此设想被其同事以实验完成验证。虽然Mullis因此获得1993年的诺贝尔化学奖，但却给分子生物学技术带来一次新的技术革命。

PCR就是通过特定引物与模板的结合，在引物的3端以DNA聚合酶实现引物的延长，这样一个与模板互补的单链就完成了合成过程。如果在互补双链DNA的特定区域两端设计引物，两个引物分别与两个单链模板互补，那么就可实现对这个特定区域的扩增。

为什么DNA复制这么重要呢？因为DNA复制可使基因这种微观的概念以宏观的形式展示给世人（如图2）。同时如Mullis所遇到的，即使是微观的DNA测序，也需要一定的DNA模板浓度。

三、PCR指数扩增原理的讲授技巧

在PCR原理讲解中其指数扩增（2n）较难以理解。可通过以下单个双链模板的扩增过程来展示PCR的指数扩增原理（图3）。具体来说，第一轮扩增反应过后，把模板链计算在内，产物增加1倍，为21；第二轮反应之后，产物在21基础上又增加1倍，变成最初产物的22倍。如此循环，在第n个反应完成之后，产物变成原来产物的2n。

四、PCR在食品微生物检测中的应用讲解

讲授完PCR原理后，教师要将学生思路拉回到第一个问题，PCR在有害微生物和有益微生物检测中如何应用？

首先，我们可通过PCR对食品中的有害和有益微生物进行定性。生物物种DNA序列并非完全相同，如果根据每种微生物DNA序列设计合成特定的引物，通过扩增与否可推断检测样品中是否含有此微生物。如细菌的rDNA（编码核糖体RNA的DNA）可作为对细菌进行定性的指标。

其次，我们可通过PCR对各种微生物进行定量，其实就是通过对产物量的鉴定来推断初始模板的量。如定性实验中所讲，我们可设计特定微生物的特异的引物，将样品中的微生物混合DNA进行扩增，特定循环数目结束后，哪种细菌特异DNA扩增产物的量多，哪种细菌的初始量就多，反之亦然。

其实PCR在定量方面，还有很多其他更加复杂的定量应用方法，如有两份样本，哪份量比较多，哪份量比较少。这时如何定量？在此情况下可选一个内参，即将数量比较恒定的细菌作为内参，如可疑菌为沙门氏菌时，可用普通的金黄色葡萄球菌为内参。以PCR方法将两份样品中的金黄色葡萄球菌的量均一后，再比较两份样本中沙门氏菌DNA PCR扩增产物的量。通过此方法，可对两份样本中沙门氏菌的量进行定量。

参考文献：

[1]Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Saiki RK，Scharf S，Faloona F，Mullis KB，Horn GT，Erlich HA.Arnheim N.Science，1985，（230）：1350-1354.

[2]Postollec F，Falentin H，Pavan S，Combrisson J，Sohier D.Recent advances in quantitative PCR （qPCR） applications in food microbiology.Food Microbiology，2011，（28）：848-861.

[3]吴燕涛，刘晓莉，曹悦，王立平.实时荧光定量PCR 法测定发酵乳中双歧杆菌[J].食品科学，2013，（34）：172-175.