意大利牛舌草中芦丁的分离及定量分析研究

常　文， 路文杰， 代己果， 马桂芝， 滕　亮

(新疆医科大学1药学院, 乌鲁木齐　830011； 2第一附属医院药学部, 乌鲁木齐　830054； 3第一附属医院昌吉分院,新疆, 昌吉　831100)



意大利牛舌草中芦丁的分离及定量分析研究

常文1， 路文杰1， 代己果1， 马桂芝1， 滕亮2,3

(新疆医科大学1药学院, 乌鲁木齐830011；2第一附属医院药学部, 乌鲁木齐830054；3第一附属医院昌吉分院,新疆, 昌吉831100)

摘要:目的确定意大利牛舌草中芦丁的分离方法并建立用于测定意大利牛舌草中芦丁含量的HPLC方法。 方法采用硅胶柱色谱对意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物进行分离纯化。建立测定意大利牛舌草中芦丁含量的反相高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱Kromasil C18(5 μm， 250 mm×4.6 mm)；以乙腈-0.2%磷酸水溶液进行线性梯度洗脱: 0～9 min 83%～80% B，9～20 min 80%～68% B，20～40 min 68%～40% B，40～45 min 40%～83%;流速1.0 mL/min；检测波长354 nm，柱温30℃。结果通过分离鉴定在意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物中得到单体化合物1，1H-NMR与13C-NMR结果提示其化合物1为芦丁。在1.64×10-3～5.255 ×10-2mL/min范围内芦丁浓度与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 7)，且不同批次的意大利牛舌草中的芦丁含量最低,为(1.299 7±0.014 1) mg/g。结论首次从意大利牛舌草中分离得到芦丁,所建立的用于测定芦丁含量的HPLC法简便、准确，重现性好，结果准确可靠，为提高意大利牛舌草的质量标准奠定了试验基础。

关键词:意大利牛舌草； 芦丁； 高效液相色谱法； 含量测定

意大利牛舌草(Anchusa italica Retz.)为紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物，主要分布于伊朗、俄罗斯等地区，全草入药，本品具有杀原虫作用，并可作缓泻剂和解热剂。意大利牛舌草维文名为高孜万，主治干寒性或黑肥质性疾病，如平性脑虚、寒性心虚、心悸、抑郁症、干性脑膜炎、肺炎及结核疾病、寒性咳嗽、感冒、气喘等。《药物之园》记载该药材具有“生湿消炎、除狂安神、消除黄疸、溶石排石及治脑膜炎、癫狂、肾结石、膀胱结石等”功效[1]。目前对意大利牛舌草的研究主要集中在总黄酮的提取与临床研究等方面，临床研究表明意大利牛舌草中的总黄酮对心脏系统疾病有一定的治疗效果[2-7]。本课题前期对意大利牛舌草的化学成分进行了初步的研究，结果表明该药材含有较为丰富的黄酮类成分[8]。本研究旨在确定意大利牛舌草乙酸乙酯萃取物中芦丁的提取分离方法(首次从意大利牛舌草中分离获得)以及建立用于测定意大利牛舌草中芦丁含量的HPLC方法，为提高意大利牛舌草的质量标准奠定试验基础，现报道如下。

1仪器与试药

1.1仪器LC-20A日本岛津高效液相色谱仪， ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)， YP1002N电子天平(上海青海仪器有限公司)，Bruker-600型核磁共振仪。

1.2试药意大利牛舌草的产地分别为巴基斯坦、印度尼西亚，经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为紫草科(Boraginaceae)多年生草木植物意大利牛舌草(Anchusa italica Retz.)的地上部分。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号 100080-200707)，乙腈为色谱纯(Sigma公司产品)，柱色谱用硅胶200-300目(青岛海洋化工厂)，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

2方法与结果

2.1意大利牛舌草中芦丁的提取、分离取意大利牛舌草10 kg，用60%乙醇提取3次，每次2 h，合并提取液后浓酸至无醇，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得乙酸乙酯萃取物约74 g，经常压硅胶(200～300目)柱层析，石油醚-乙酸乙酯(50∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度冲洗，每个梯度约20个柱体积，得到18个部分(Fr.1～Fr.18)。Fr.17(3.2 g)经常压硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(50∶1、20∶1、10∶1、7∶1、5∶1、2∶1、1∶1)梯度洗脱，分为8个部分(Fr.17．1～Fr.17.8)。Fr．17.7(1.2 g)经常压硅胶柱色谱，石油醚-乙酸乙酯(50∶1,20∶1,10∶1,7∶1,5∶1,2∶1,1∶1)梯度洗脱，分为12个部分，Fr.17.10有黄色粉末，用不同的试剂纯化，得化合物1(4.1 mg)。

2.2结构鉴定化合物1 黄色粉末 (甲醇) 。1H-NMR (600MHz, MeOD) δ:7.68 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2′), 7.64 (1H, dd, J=2.4, 1.8 Hz, H-6′), 6.88 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.21 (1H, d, J=1.2 Hz, H-6)，13C-NMR (150 MHz, MeOD)δ:158.48 (C-2), 135.65 (C-3), 179.39 (C-4), 162.95 (C-5),99.95 (C-6), 166.01 (C-7), 94.88 (C-8), 159.33 (C-9), 104.76 (C-10), 123.11 (C-1′), 116.06 (C-2′), 145.82 (C-3′),149.8 (C-4′), 117.71 (C-5′), 123.58 (C-6′),102.42 (C-1''), 105.62(C-1''')。以上数据与文献[9]一致，故确定化合物为芦丁(Rutin)。

2.3HPLC法测定意大利牛舌草中芦丁的含量

2.3.1色谱条件[10-15]Kromasil C18色谱柱(5 μm， 250 mm×4.6 mm)；流动相：乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)梯度洗脱：0～9 min 83%～80% B，9～20 min 80%～68% B，20～40 min 68%～40% B，40～45 min 40%～83% B；流速：1.0 mL/min；检测波长：354 nm；柱温：30℃；进样体积：20 μL。在该色谱条件下样品中芦丁与相邻色谱峰分离度良好，理论塔板数按芦丁计算大于5 000，对照品和供试品色谱图见图1。

图1　芦丁对照品(a)和样品(b)液相色谱图

2.3.2对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品10 mg 于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，精密移取1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成每毫升约含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.3供试品溶液配制称取2.5 g意大利牛舌草粉末，精密称定，加入60%乙醇15 mL 80℃ 回流提取3次，每次2 h，合并提取液，定容至50 mL，放冷至室温，取5 mL减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，微孔滤膜(0.22 μm)过滤，续滤液即为供试品溶液。

2.3.4线性关系考察精密移取芦丁对照品溶液用倍量稀释法得等梯度浓度的对照品溶液，分别精密吸取不同浓度的对照品溶液20 μL (5.255×10-2、2.628×10-2、 1.314×10-2、6.57×10-3、3.28×10-3、1.64×10-3mg/mL)注入高效液相色谱仪，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)对芦丁浓度(X， mg/mL) 进行线性回归，方程为Y=27 168 911X+13 786.8 (r=0.999 7)，结果表明在1.64×10-3～5.255×10-2mg/mL范围内峰面积与芦丁浓度线性关系良好。

2.3.5精密度试验

2.3.5.1日内精密度分别取不同浓度(1.64×10-3、1.314×10-2、5.255×10-2mg/mL)对照品溶液20 μL，连续进样5次，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，RSD值分别为0.78%、 1.05%、1.24%。

2.3.5.2日间精密度分别取不同浓度(1.64×10-3、1.314×10-2、5.255×10-2mg/mL)对照品溶液20 μL，连续进样3 d，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，RSD值分别为1.12%、 1.48%、 1.16%。精密度试验结果提示仪器精密度符合方法学要求。

2.3.6稳定性试验取意大利牛舌草粉末，照样品处理方法进行处理后，于常温下放置0、2、4、6、12、24 h，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积，RSD为1.91%，结果表明供试品在24 h内稳定性良好。

2.3.7重复性试验取同一批意大利牛舌草粉末6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积并计算含量，RSD为1.90%，表明该方法重现性良好。

2.3.8加样回收试验取9份已知芦丁含量的意大利牛舌草粉末约2.5 g，精密称定，分别精密加入芦丁对照品(0.030 3 mg/mL)8、10、12 mL，按前法制备供试品溶液，按 “2.3.1”项下色谱条件测定峰面积并计算含量，结果平均加样回收率分别为98.5%、99.0%、99.4%，RSD值分别为0.38%、0.62%、1.86%,见表1。

表1　芦丁加样回收试验(n=9)

2.3.9样品含量测定分别精密称定不同产地的牛舌草2.5 g，按前法制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定峰面积并计算含量，结果在1.64×10-3～5.255 ×10-2mL/min范围内芦丁浓度与其峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 7)，且不同批次的意大利牛舌草中的芦丁含量最低,为(1.299 7±0.014 1) mg/g,见表2。

表2　不同产地意大利牛舌草中芦丁的含量测定(n=3)

3讨论

牛舌草具有抗炎、抗癌、抗心肌缺血再灌注损伤等作用[16]，这些药理作用的物质基础则是药材所含的多种成分。本课题组前期研究表明意大利牛舌草所含黄酮类成分较多[17]。本研究则采用传统的天然药物化学研究手段在意大利牛舌草的乙酸乙酯提取物中首次分离鉴定了芦丁，为后期该药材药效物质基础研究奠定了基础；在分离鉴定的基础上，建立了符合方法学要求的测定药材中芦丁含量的HPLC法，方法简便、可行，对意大利牛舌草质量控制有一定意义。本课题组将对意大利牛舌草的黄酮类成分进行深入的研究，同时也会结合药理学研究手段探索其可能的作用机制。

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(本文编辑施洋)

Separation and identification of rutin in Anchusa italica Retz.

CHANG Wen1, LU Wenjie1, DAI Jiguo1, MA Guizhi1, TENG Liang2,3

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofPharmacy,theFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China;3BranchoftheFirstAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,XinjiangChangji831100,China)

Abstract：ObjectiveTo separate and identify the contents of rutin extracted from Anchusa italica Retz.．MethodsThe ethyl acetate extracts were isolated and separated by silica gel, the structure was identified by1H-NMR and13C-NMR. The contents identification of rutin was performed by RP-HPLC. The conditions of HPLC was as follows: Kromasil C18(5 μm，250 mm×4.6 mm) columns was used and gradient elution solvents was the mixture of acetonitrile and 0.2% phosphoric acid, the flow rate was 1.0 mL/min, the detective wave length was at 354 nm, column temperature was 30℃。ResultsRutin was obtained and identified from Ethyl acetate extracts. There was a linear relationship between concentration of rutin and peak area in the range of 0.00164 mL/min～0.05255 mL/min, and the content of rutin in different batches Anchusa italica Retz. is 1.2997±0.0141 mg/g. ConclusionRutin were firstly isolated from Anchusa italica Retz. The identification method using HPLC was simple, accurate and reliable, which lays the experimental fundatioin for the establishment of quality standard of Anchusa italica Retz.

Keywords：Anchusa italica Retz.; rutin; HPLC; determination

[收稿日期：2016-01-08]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.016

中图分类号：R914

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0591-04

作者简介：常文(1988-)，女，在读硕士，研究方向：中药民族药研究。通信作者：马桂芝，女(回族)，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药民族药研究，E-mail：maguizhi000@126.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目(201130105)