ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响

王虎军， 钱　璇， 方　荃， 马少林

(1新疆医科大学第一附属医院整形外科, 乌鲁木齐　830054; 2新疆医科大学, 乌鲁木齐　830011)



ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响

王虎军1,2， 钱璇1， 方荃1， 马少林1

(1新疆医科大学第一附属医院整形外科, 乌鲁木齐830054;2新疆医科大学, 乌鲁木齐830011)

摘要：目的探讨维药异常胆质成熟剂提取物总黄酮(Abnormal Savda Munziq-Total Flavonoids, ASMq-TF)在体外对增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic scar, Fibrofblasts, HSFbs)迁移能力的影响。方法培养人来源增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞，将实验设计分为6组：正常皮肤组、空白对照组、实验组(ASMq-TF 0.2、0.35、0.5 mg/mL)和5-氟尿嘧啶(0.25 mg/mL)阳性组；通过细胞划痕实验方法，分别在24、48 h后，观察ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率的影响。结果在同一时间，与正常皮肤组比较，空白对照组增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率明显增加(P<0.05)；与空白对照组比较，随着实验组ASMq-TF浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞迁移率逐渐减少(P<0.05)；与ASMq-TF 0.2 mg/mL实验组比较，5-氟尿嘧啶阳性组对增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率减少(P<0.05)。结论增生性瘢痕成纤维细胞迁移率明显高于正常皮肤成纤维细胞； 随着ASMq-TF浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞迁移率逐渐被抑制，同时也影响成纤维细胞过度增殖，进一步减少增生性瘢痕形成。

关键词：异常胆质成熟剂总黄酮； 增生性瘢痕； 细胞迁移率

增生性瘢痕(Hypertrophic Scar HS)是皮肤损伤后成纤维细胞(fibroblast FB)过度增殖和细胞外基质胶原沉积所致。成纤维细胞是创面修复的主要细胞，其可通过迁徙、增殖、分化、合成、分泌胶原及凋亡等生物学行为的有序参与创面修复过程[1]。因此通过减弱成纤维细胞迁移运动，进一步减少其增殖，降低其分泌胶原沉积，对于有效抑制增生性瘢痕形成具有重要的临床意义。当前在增生性瘢痕的预防治疗中，临床上缺乏较为理想有效的方法。根据维医药理论，维药异常黑胆质成熟剂(Abnormal Savda Munziq，ASMq)治疗肿瘤等疾病取得了较好效果，其中对肿瘤细胞的迁移能力有明显的抑制作用。本课题组前期实验证明，维药异常黑胆质成熟剂(ASMq)对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和迁移具有明显的抑制作用[2]。本实验将进一步探索维药异常胆质成熟剂提取物总黄酮(Abnormal Savda Munziq-Total Flavonoids, ASMq-TF)对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力的影响，为进一步临床防治增生性瘢痕提供可靠理论科学依据。

1材料与方法

1.1实验材料增生性瘢痕的组织来源于新疆医科大学第一附属医院整形门诊，选择烧伤或术后6个月以上的瘢痕患者(男性1例，女性2例，年龄25～38岁)门诊手术所切的瘢痕组织标本；正常皮肤组织来源于门诊手术环切包皮标本；患者均签手术知情同意书。增生性瘢痕临床症状表现：外观发红充血、质硬、凸出于皮肤表面、 局限于皮损区； 伴有瘢痕发红、痒、痛症状明显为标准，术后病理结果确诊；局部无激素注射史、无放疗、无溃疡及感染，无其他慢性疾病史。

1.2仪器和试剂10 cm 培养皿(美国 Cornin)，6孔培养板、枪头(美国Corn)，移液器 (Eppendorf 公司)，CO2细胞培养箱(Thermo Scientific)，离心机 (美国 Sigma)，超净台(Airtech公司)，倒置显微镜(德国 Leica 公司)， DEME 细胞培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国 Hyclone公司)，胰蛋白酶(美国 Hyclone公司)，PBS缓冲液(美国 Hyclone公司)。

1.3药物试剂维药异常黑胆质成熟剂(Abnormal Savda Munziq，ASMq， 国药准字：Z65020166)由新疆维吾尔药业有限责任公司和新疆医科大学维吾尔医学院支持赞助，异常黑胆质成熟剂总黄酮(新疆医科大学中医学院特色方剂实验室提纯)。ASMq-TF的溶液配置：用10 g ASMq-TF超声乳化配入100 mL的双蒸水，浓度为100 mg/mL，该浓度的溶液为一级母液,由新疆医科大学第一临床医学院药剂实验室配置，用一级母液4 mL配入44 mL DMEM 培养基中，终浓度为10 mg/mL，即为二级母液。

1.4实验方法

1.4.1正常皮肤组织和增生性瘢痕组织成纤维细胞细胞培养采用组织块培养法进行体外细胞培养。在无菌条件下切除表皮及皮下脂肪(增生性瘢痕和包皮)，将标本制成1 cm3左右的组织块置于10 cm培养皿中，加入适量含10%胎牛血清的DMEM培养液，在95%空气、5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养；3～4 d换液1次，2～3 w后，在细胞汇集率达到80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶消化后，按1∶3比例传代细胞培养，传代细胞3～6代备用实验。

1.4.2ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞处理取处于对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞：生长呈放射状、漩涡状排列、细胞胞体透明清晰、形态规则、有多个扁平而长的突起；在成纤维细胞汇集率达到80%～90%时，实验组分别加入DMEM配制的终浓度为0、0.2、0.35、0.5 mg/mL的ASMq-TF作用增生性瘢痕成纤维细胞48 h后，在倒置显微镜下观察其细胞形态、数量及密度变化情况。

1.4.3细胞划痕实验将正常皮肤和增生性瘢痕的成纤维细胞分别以细胞计数2×104个/孔加2 mL含10% FBS 的DMEM培养液接种于6 孔板中(正常皮肤成纤维细胞接种1孔，增生性瘢痕成纤维细胞接种5孔，其中在增生性瘢痕成纤维细胞接种的5孔中，设计1孔为空白对照组，3孔为实验组，1孔为5-氟尿嘧啶阳性组)过夜。观察6孔板中成纤维细胞基本贴壁后，正常皮肤组加入等体积溶剂的培养液，空白对照组加入等体积溶剂的培养液，3个实验组分别加ASMq-TF 0.2、0.35、0.5 mg/mL，5-氟尿嘧啶阳性组加5-氟尿嘧啶0.25 mg/mL。分别用200 μL的无菌枪头垂直划痕，用PBS缓冲液洗细胞2遍，培养24、48 h后观察细胞的迁徙能力(用迁移率表示)。在倒置显微镜下随机选择 3个100倍视野测量划痕内面垂直距离及划痕创面的宽度，以原始距离减去各个时间点划痕创面的宽度计算出细胞迁移的相对距离，按公式计算细胞的相对迁移率：细胞相对迁移率=细胞迁移的相对距离/划痕区的原始距离×100%，并且在倒置显微镜观察各组实验迁移率的变化。

2结果

2.1培养人正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞原代和传代生长情况人正常皮肤和人增生性瘢痕组织块同时接种12 d 后，均见有成纤维细胞从组织块边缘爬出，贴壁良好，细胞呈梭形散在分布，逐渐向周围扩展，局部细胞开始融合。但与正常皮肤成纤维细胞数量比较，增生性瘢痕成纤维细胞数量明显增加。第3代传代细胞接种4 d时，大部分细胞贴壁，细胞边缘清晰，胞体透亮，增生性瘢痕成纤维细胞多呈放射状、漩涡状排列生长，细胞体呈长梭形、不规则三角形，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞核逐渐增大。正常皮肤成纤维细胞胞体呈长梭形散在，有胞质向外伸出突起，细胞排列多呈平行有序生长(图1)。

2.2不同浓度的ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞的影响不同浓度ASMq-TF作用人增生性瘢痕成纤维细胞48 h后，随着浓度的增加，细胞逐渐松散，细胞间隙增加，脱落及悬浮细胞增加，排列方向紊乱，胞体皱缩变小，两极梭状突起回缩，变成不规则的短突出，与邻近细胞接触减少；其中0.5 mg/mL实验组细胞形态变化更为显著，部分细胞失去纤维化细胞样特征。空白对照组培养的增生性瘢痕的成纤维细胞持续增殖，数量增加，密度加大，逐渐铺满皿底；与空白对照组比较，随着ASMq-TF浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞数量增加的速度减慢，细胞间隙逐渐增宽，密度逐渐稀疏； 0.5 mg/mL实验组抑制作用最为明显，至后期细胞数量明显减少(图2)。

a: 增生性瘢痕来源成纤维细胞(P0，12 d)

b: 增生性瘢痕来源成纤维细胞(P3，4 d)

c: 正常皮肤来源的成纤维细胞(P0，12 d)

d: 正常皮肤来源的成纤维细胞(P3，4 d)

注: P0：原代成纤维细胞； P3：第3代成纤维细胞。

图1正常皮肤组织和增生性瘢痕组织成纤维细胞原代和第3代培养

a: ASMq-TF 0 mg/mL

b: ASMq-TF 0.2 mg/mL

c: ASMq-TF 0.35 mg/mL

d: ASMq-TF 0.5 mg/mL

图2不同浓度ASMq-TF 对增生性瘢痕成纤维细胞的影响

2.3ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞划痕迁移实验培养24 h和48 h后，与正常皮肤组比较，空白对照组成纤维细胞迁移率明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；培养 24 h后，与空白对照组相比，随着实验组ASMq-TF浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞体外迁移率明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；培养 48 h后，与空白对照组比较，随着实验组ASMq-TF 浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞体外迁移率明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；培养 24 h后，与实验组比较，5-氟尿嘧啶阳性组增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率减少，差异有统计学意义(P<0.05)；培养48 h后，与ASMq-TF 0.2 mg/mL实验组比较，5-氟尿嘧啶阳性组增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率减少，差异有统计学意义(P<0.05)(图3)(表1)。

3讨论

成纤维细胞(fibroblast，FB)是创面修复的主要细胞，其可通过迁徙、增殖、分化、合成、分泌及凋亡等生物学行为的有序进行参与创面修复过程[3]。创面正常愈合是FB、细胞因子及细胞外基质间相互作用达到平衡状态的结果[4-5]。当细胞因子、细胞外基质及FB等的相互调节平衡失调，可致FB的生物学行为发生变化，致使增生性瘢痕形成[6]。因此，FB的生物学行为与创面正常愈合及增生性瘢痕的形成密切相关。综合了解影响瘢痕FB生物学行为的因素，寻求一条综合调节瘢痕FB生物学行为及其因素的方法，对于促进创面正常愈合及防治瘢痕形成均有重要意义。

表1　ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞迁移率的影响(±s)

注：与正常皮肤组比较，△P<0.05; 与空白对照组比较,▲P<0.05; 与ASMq-TF 0.2 mg/mL实验组比较，★P<0.05。

a: 正常皮肤组; b： 空白对照组; c： ASMq-TF 0.2 mg/mL实验组; d： ASMq-TF 0.35 mg/mL实验组; e： ASMq-TF 0.5 mg/mL实验组; f： 5-氟尿嘧啶0.25 mg/mL阳性组

图3细胞划痕实验

目前，增生性瘢痕的治疗主要通过手术治疗与非手术治疗[7]。非手术治疗包括药物治疗、压迫疗法、放射治疗、激光治疗、冷冻治疗及聚硅酮的应用，均取得了一定临床疗效，但仍存在许多不易解决的问题。而对于瘢痕的药物治疗仅限于非特异性抗炎药物、免疫抑制剂及糖皮质激素等[8]。这些药物不仅不良反应较多，而且疗效不理想，使其在临床应用上受到很大的限制。因此，寻找新的防治增生性瘢痕的有效方法仍然是目前医学领域，尤其是烧伤整形外科学领域中的一项重要课题。

维医维药理论认为，体内各种营养物质在肝中产生的各种液体总称为体液，体液是人类生命及生理活动过程的基本物质。体液分为胆液质、血液质、黏液质和黑胆质4种[9]，4种体液脱离自然的正常状态，在数量和质量上发生改变，成为对人体无益或有损的体液，称为异常体液。异常黑胆质是在体内外各种因素的作用下，人体内胆质体液的量增加，功能改变，在机体基础“热”的作用下“燃烧”，最终形成异常黑胆质，是许多疾病在维医病理生理上所共有的特性，治疗上主要采用异常黑胆质成熟剂(Abnormal Savda Munziq，ASMq)进行调整[10]。ASMq由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青兰子、黑种草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、罗勒子、蜀葵子、茴芹果、骆驼蓬子等13味维药调制而成[11]，既往研究表明, ASMq-TF对肝癌等肿瘤细胞有明显的抑制作用[12-14]。因为肿瘤的迁移生物特性与增生性瘢痕迁移特性具有相似性，本课题前期实验证明运用不同浓度的AMSq对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和迁移均有抑制作用,同时具有诱导成纤维细胞凋亡的作用[15]。

本实验观察不同浓度ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞形态的影响，其作用48 h后，随着浓度的增加，细胞逐渐松散，细胞间隙增加，脱落及悬浮细胞增加，排列方向紊乱，胞体皱缩变小，两极梭状突起回缩，变成不规则的短突出，与邻近细胞接触减少；其中0.5 mg/mL 实验组细胞形态变化更为显著，部分细胞失去纤维化细胞样特征。说明ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞有明显的抑制作用。根据实验分组设计进行细胞划痕迁移实验，结果显示培养24 h和48 h后，与正常皮肤组比较，空白对照组成纤维细胞迁移率明显增加(P<0.05)，说明增生性瘢痕的成纤维细胞表现为过度增殖和迁移，增生性瘢痕成纤维细胞的迁移能力明显高于正常皮肤成纤维细胞。培养 24 h后，与空白对照组比较，随着实验组ASMq-TF浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞体外迁移率明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；培养 48 h后，与空白对照组比较，随着实验组ASMq-TF 浓度的增加，增生性瘢痕成纤维细胞体外迁移率明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，说明随着维药异常黑胆质成熟剂总黄酮浓度逐渐增加，增生性瘢痕成纤维细胞迁移率显著减少，ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力有抑制作用，尤其在ASMq-TF 0.5mg/mL 时抑制增生性瘢痕成纤维细胞迁移能力显著。培养 24 h后，与实验组比较，5-氟尿嘧啶阳性组增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率减少，差异有统计学意义(P<0.05)；培养48 h后，与ASMq-TF 0.2 mg/mL实验组比较，5-氟尿嘧啶阳性组增生性瘢痕成纤维细胞的迁移率减少，差异有统计学意义(P<0.05)，5-氟尿嘧啶阳性组细胞的迁移能力明显低于各实验组细胞的迁移能力，5-氟尿嘧啶阳性组不仅有延迟伤口的愈合，而且有损伤正常细胞再生的现象，说明ASMq-TF 不仅促进伤口愈合，而且抑制增生性瘢痕形成。其机制可以理解为：在ASMq-TF干预下，增生性瘢痕成纤维细胞(FB)的生物学行为发生变化，主要是成纤维细胞的迁移能力受到抑制，相对应成纤维细胞的增殖能力减弱，减少对细胞外基质(ECM)的分泌，同时促使胶原蛋白的降解。表明维药异常胆质成熟剂提取物总黄酮能明显降低人增生性瘢痕成纤维细胞的体外迁移能力，并呈剂量和时间依赖性；发现ASMq-TF作用在伤口的愈合过程中既可防止成纤维细胞过度增殖和迁移，又能促进伤口正常愈合。今后将进一步研究ASMq-TF对增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响，为防治增生性瘢痕新药的研发提供了一定的理论依据。

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(本文编辑杨晨晨)

Effects of Abnormal Savda Munziq-Total Flavonoids (ASMq-TF) on the migration ability of fibroblasts derived from Hypertrophic Scar in vitro

WANG Hujun1,2, QIAN Xuan1, FANG Quan1, MA Shaolin1

(1DepartmentofOrthopaedicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China；2XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Abnormal Savda Munziq-Total Flavonoids (ASMq-TF) on the migratory ability of hypertrophic scar fibroblast in vitro. MethodsTo primary culture the normal skin and hypertrophic scar fibroblasts from human sources in vitro, the experiment was grouped into six: the fibroblast from normal skin group, the fibroblast from hypertrophic scar blank control group and three experimental groups (the different concentration of ASMq-TF was 0.2, 0.35, 0.5 mg/mL and the postitive control group (treated with 5-FU 0.25 mg/mL) after effect on 24, 48 h. cell scratch test method was used to observe the mobility ratio of fibroblasts from hypertrophic scar treated with ASMq-TF. ResultsThere was significant difference of migratory ability between the fibroblast normal skin group versus hypertrophic scar fibroblasts group (P<0.05)； the blank control group compared with the various concentration of ASMq-TF were increased in hypertrophic scar fibroblast mobility ratio were significantly decreased (P<0.05)；the postitive contol group (5-FU 0.25 mg/mL) effect on the hypertrophic scar fibroblast mobility ratio was decreased significantly compared with experimental group (P<0.05). ConclusionThe mobility ratio hypertrophic scar fibroblast was significantly higher than that of normal skin fibroblst; the ASMq-TF can inhibit the mobility of hypertrophic scar fibroblasts, further suppressing the formation of hypertrophic scar.

Keywords：ASMq-TF； hypertrophic scar fibroblasts； mobility ratio

[收稿日期：2015-12-04]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.009

中图分类号：R62

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0560-05

作者简介：王虎军(1974-)，男，副主任医师，博士，研究方向：瘢痕形成机制与防治研究。通信作者：马少林，硕士，主任医师，博士生导师，研究方向：瘢痕形成机制与防治研究，E-mail：mashaolin9@163.com。

基金项目：国家科学自然基金(81260291)； 第57批博士后科学基金面上项目