异常黏液质型阳痿病证大鼠生精细胞凋亡及伊木萨克片干预研究

买买提祖农·买苏尔， 古丽沙依拉·队三拜， 张盼盼， 阿地力江·伊明，毛吾兰·买买提依明， 刘凤霞， 陈胜国

(新疆医科大学基础医学院1病理生理学教研室， 2人体解剖学教研室， 3细胞生物学教研室， 乌鲁木齐　830011)



异常黏液质型阳痿病证大鼠生精细胞凋亡及伊木萨克片干预研究

买买提祖农·买苏尔1， 古丽沙依拉·队三拜1， 张盼盼2， 阿地力江·伊明2，毛吾兰·买买提依明3， 刘凤霞2， 陈胜国2

(新疆医科大学基础医学院1病理生理学教研室，2人体解剖学教研室，3细胞生物学教研室， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的研究异常黏液质型阳痿病证大鼠生精细胞凋亡及维药伊木萨克片对其影响。方法选用100只雄性SD大鼠，随机选取10只为正常组，余90只为造模组，以湿寒饲料+湿寒性环境的干预条件建立异常黏液质证候模型， 20 w后从证候组中筛选出阳痿病证模型后，将其分为病证模型组和病证药物干预组，剩余证候模型分为证候模型组、证候药物干预组，干预2 w，取材后对睾丸用苏木精-伊红 ( hematoxylin-eosin，HE)染色后光镜下观察其睾丸组织病理改变，原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法检测生精细胞的凋亡情况。结果(1)HE染色结果：正常组结构完好；证候模型组生精细胞数量明显少于正常组，间质细胞及精子数量减少；病证模型组生精小管萎缩或扭曲成不规则形，生精细胞和间质细胞数量显著少于正常组；证候药物干预组生精小管形态、生精细胞数量及管腔内精子数量基本同正常组，间质细胞增多；病证药物干预组生精细胞数量较病证模型组有所增多，精子数量依旧少于正常组。(2)凋亡检测结果：证候模型组及病证模型组生精细胞凋亡较正常组显著增多(P<0.01)，经伊木萨克片干预后凋亡数量下降(P<0.01)。结论维医异常黏液质型阳痿病证大鼠模型睾丸组织发生病理学改变，生精细胞发生异常凋亡，伊木萨克片干预可有效减少异常凋亡。

关键词：异常黏液质； 阳痿； 生精细胞凋亡

据世界卫生组织(world health organization, WHO)统计，不孕不育的发生占育龄夫妇的10%～15%，其中男性因素约占50%，生精细胞的异常凋亡是导致男性不育的重要原因之一[1]。本课题组前期研究发现异常黏液质型阳痿病证大鼠模型精子数量显著低于正常大鼠[2]。为探讨模型精子数量减少的核心机制，本研究就异常黏液质型阳痿病证大鼠模型睾丸组织病理学改变以及生精细胞凋亡情况进行进一步研究与探讨，并应用对证药物伊木萨克片进行干预，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物选取正常SD雄性大鼠100只，雌性20只(用于交配实验)，体质量为(200±20)g，均由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2主要设备与药品、试剂人工气候箱(上海博迅实业有限公司，型号：BIC-400)，阿扑吗啡(美国Sigma公司)，伊木萨克片(新疆和田维吾尔药业有限责任公司，批号：20130501)，细胞凋亡试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3动物模型的建立和分组随机取10只雄性SD大鼠为正常组，余90只为造模组，参照文献[3]建立异常黏液质证候及阳痿病证大鼠模型，将其随机分为证候模型组、病证模型组、证候药物干预组、病证药物干预组，其中药物干预组于常规条件下饲养，常规饮食，并用对证药物伊木萨克片250 mg/kg体质量灌胃，每天1次，反证时间为2w。

1.4标本采集与切片制备1%戊巴比妥钠40 mg/kg体质量腹腔注射麻醉大鼠，取其睾丸，于4%多聚甲醛固定。48 h后， 70%酒精充分冲洗，上行梯度酒精(80%、90%、95%、100%)脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备4 μm切片，贴于APES处理过的载玻片。

1.5观察指标与方法

1.5.1苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色常规二甲苯脱蜡，下行梯度酒精(100%、95%、80%、70%)、蒸馏水漂洗后，入苏木素染色10 min，自来水冲洗1～2 min，1%盐酸酒精分化1～3 s，自来水冲洗至水无色，氨水5～10 s，自来水冲洗1～2 min，伊红溶液浸染6 min，上行梯度酒精(70%、80%、95%、100% )脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.5.2原位末端转移酶标记技术(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)法检测生精细胞凋亡情况切片脱蜡至水，3%H2O2室温孵育10 min，TBS冲洗；蛋白酶K37℃孵育20 min，TBS充分冲洗；滴加反应混合液20 μL(18 μL标记缓冲液+1 μL DNA末端转移酶+1 μL DIG-d-UTP)，湿盒中37℃孵育120 min，TBS冲洗；加封闭液50 μL/片，室温孵育30 min；将抗体稀释液和生物素化地高辛以1∶100的比例混匀后，50 μL/每张，37℃反应30 min；TBS冲洗；每片滴加50 μL SABC，37℃反应30 min；DAB显色，苏木素复染，中性树胶封固。光镜下观察凋亡结果，胞核呈棕褐色为阳性细胞，计数方法按Gatius等[4]的方法进行计数。

2结果

2.1HE染色结果(1)光镜下正常组可见各级生精细胞排列密集，间质细胞成群分布，核圆形，染色质较淡；(2)证候模型组生精细胞数量明显少于正常组，间质细胞及精子数量较正常组减少；(3)病证模型组生精小管萎缩或扭曲成不规则形，生精细胞和间质细胞数量显著少于正常组；(4)证候药物干预组生精小管形态、生精细胞数量及管腔内精子数量基本同正常组，间质细胞增多；(5)病证药物干预组生精细胞数量较病证模型组有所增多，精子数量依旧少于正常组(图1)。

a： 正常组； b： 证候模型组； c： 病证模型组； d： 证候药物干预组； e： 病证药物干预组

2.2生精细胞凋亡结果光镜下可见凋亡的生精细胞核固缩，被特异性染成深棕褐色，以精原细胞为主。证候模型组及病证模型组生精细胞凋亡较正常组显著增多，差异有统计学意义(P<0.01)，经伊木萨克片干预后，证候药物干预组生精细胞凋亡数量少于证候模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；病证药物干预组生精细胞凋亡数量少于病证模型组，多于正常组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1、图2。

表1　各组大鼠睾丸各级生精细胞凋亡结果(±s)

注：与正常组比较，*P<0.05； 与证候模型组比较，▲P<0.05； 与病证模型组比较，#P<0.05。

a： 正常组； b： 证候模型组； c： 病证模型组； d： 证候药物干预组； e： 病证药物干预组

3讨论

随着生活压力增大、环境污染等原因，男性精子数量与质量呈下降趋势[5]。本课题组前期研究发现异常黏液质型阳痿病证大鼠模型精子活率与活力显著降低,但机制不详[2]。故本研究在此基础上，再一次制备了该病证与证候模型，并在对证药物进行治疗性干预的基础上开展进一步的研究。

本研究经睾丸组织HE染色结果显示异常黏液质型阳痿病证大鼠睾丸生精上皮明显变薄，生精细胞数量明显减少，生精小管内精子数量显著下降，提示睾丸组织的形态学改变可能是异常黏液质型阳痿病证大鼠精子数量减少的的病理学基础。

此外，精子数量、质量与生精细胞的凋亡也密切相关，生精细胞的异常凋亡在精子早期病变中即所有反映。有研究表明正常男性生精细胞凋亡率仅为0.1%，而精索静脉曲张(varicocele，VC)患者凋亡率为10%，隐睾(cryptorchid)患者生精细胞凋亡率为20%，精原细胞瘤(seminoma，SGCT)患者生精细胞凋亡率为50%[6]。并已有研究证实生精细胞过度凋亡会导致少弱畸精子症[7-8]。本研究结果显示，异常黏液质证候及阳痿病证模型大鼠生精细胞凋亡数量显著高于正常组，经对证维药伊木萨克片干预后可使其部分恢复，提示异常黏液质型阳痿病证大鼠精子数量的下降与生精细胞的过度凋亡相关。进一步究其凋亡原因，内分泌紊乱是影响生精细胞凋亡的重要因素之一。Fan等[9]报道运用毒性药物选择性杀伤睾丸间质细胞，抑制其睾酮的产生，结果大部分生精细胞凋亡。本课题组前期研究用放免法检测异常黏液质证候及阳痿病证大鼠外周血清睾酮含量，发现其睾酮含量显著降低[10]。因此，可以认为睾酮含量的降低或许是精子发生异常凋亡的重要原因之一。

维药伊木萨克片是新疆和田地区维吾尔医院的名老维医多年临床经验总结出来的经典方剂，该药是由麝香、龙涎香、牛鞭、罂粟壳、西红花、乳香、丁香、等组方而成，具有补肾壮阳、益精固涩之功效。本课题组前期研究结果显示伊木萨克片可显著提高大鼠睾酮水平[10]。而本研究结果显示经伊木萨克片对证干预异常黏液质证候及阳痿病证大鼠后，睾丸组织的病理学改变可部分恢复，且生精细胞的过度凋亡可得到有效抑制。

综上所述，异常黏液质型阳痿病证大鼠模型睾丸组织发生病理学改变，生精细胞发生过度凋亡，这可能是该模型精子活率与活力下降的原因之一，而睾酮含量的降低可能是组织病理学改变及凋亡的重要原因。对证维药伊木萨克片可通过修复睾丸组织症理学改变，提高血清中睾酮水平，并抑制生精细胞过凋亡来发挥治疗作用，但具体机制尚待进一步研究。

参考文献：

[1]De Melo-Martin I.On cloning human beings[J].Bioethics,2002,16(3):246-265.

[2]阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证侯与阳痿病证大鼠模型生精功能改变的研究[J].新疆医科大学学报,2012,35(11):1445-1449.

[3]阿地力江·伊明,范强,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质阳痿病证动物模型的建立与反证[J],中国男科学杂志,2011,25 (9):3-9.

[4]Gatius S,Velasco A,Azueta A,et a1.Dolcet X,Prat J,Matias-Guiu X.FGFR2 alterations in endometrial carcinoma[J]．Mod Pathol，2011,24(11):1500-1510．

[5]王琦,秦国政.王琦男科学[M].郑州:河南科学技术出版, 2007:315.

[6]曹兴午.精液生精细胞检查与临床意义[J].中华检验医学杂志,2006,29(10):956-959.

[7]吕逸清,陈斌,胡凯,等.精子凋亡率与精子密度、活率、活力及活性氧关系探讨[J].中华男科学杂志,2009,23(2):34-37.

[8]朱登祥,盂昭影,魏会平,等．男性不育与精子凋亡关系的究[J]．中国优生与遗传杂志,2009,17(1):89-90．

[9]Fan X,Robaire B, Orchidectomy induces a wave of apoptotic cell death in the epididymis[J].Endocrinology,1998,139(4):2128-2136.

[10]阿地力江·伊明,潘建春,哈木拉提·吾甫尔,等.维医异常黏液质证侯与阳痿病证大鼠模型生殖激素 的改变及其生物学意义[J].新疆医科大学学报,2012,35(11):1438-1444.

(本文编辑周芳)

The study on germ cells apoptosis of abnormal phlegmatic impotence rats and the intervention by Yimusake tablets

Maimaitizunong Maisuer1, Gulishayila Duisanbai1， ZHANG Panpan2, Adilijiang Yingming2,Maowulan Maimaitiyiming3, LIU Fengxia2， CHEN Shengguo2

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofHumanAnatomy,3DepartmentofBiology,CollgeofBasicMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo study the apoptosis of germ cell of abnormal phlegmatic impotence rat’s testicular tissue and the interventional influence using Yimsake. MethodsA total of 100 normal mature male SD rats were enrolled in the study, 10 of them were randomly chosen as the nomal group, the other 90 were treated with spinach and coriander diet in a cold and humid until the model of abnormal phlegmatic syndrome was established. Biological characteristics of rats were observed about 20 weeks until establishment abnormal phlegmatic group, then through APO erectile experiment and matching experiment, the rats were randomly divided into abnormal phlegmatic syndrome group, medication intervention of abnormal phlegmatic syndrome group, abnormal phlegmatic syndrome impotence disease model group, and medication intervention group of abnormal phlegmatic syndrome impotence group. After2 weeks intervention, hematoxylin-eosin (HE) staining was carried out to observe the morphological changes of all rats’s testicular tissue and then through TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling to test germ cell apoptosis. ResultsHE staining result showed that the morphological structure of normal group is normal. Compared with normal group, the quantity of abnormal phlegmatic group’s germ cells was significantly decreased and its leydig cells and sperm were decreased as well. Compared with normal group the testicular morphological structure of abnormal phlegmatic impotence group was twisted and out of order and its germ cells were significantly fewer. The morphological structure and quantity of germ cells of medical intervention abnormal phlegmatic group was almost the same as normal group. Compared with abnormal phlegmatic impotence group the quantity of germ cell of medical intervention abnormal phlegmatic impotence group was increased but still less than normal group.(2)Apoptosis detection result showed that the abnormal phlegmatic syndrome group and the abnormal phlegmatic impotence group germ cells apoptosis was significantly increased compared with normal group (P<0.01) and after Yimusake tablet intervention, both model groups germ cells apoptosis level was markedly decreased (P<0.01). ConclusionThe testicular morphological structure of Uyghur medical abnormal phlegmatic with impotence rats was histopathologically changed, germ cells had apoptosis, those pathological situations recovered after Yimusake tablet medication intervention.

Keywords:abnormal phlegmatic syndrome; germ cell apoptosis; morphology

[收稿日期：2016-03-06]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.005

中图分类号：R291.5

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0542-04

作者简介：买买提祖农·买苏尔(1964-)，男(维吾尔族)，教授，硕士生导师，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究。通信作者：阿地力江·伊明，男(维吾尔族)，博士, 教授，博士生导师，研究方向：生殖健康的中维西医结合研究， E-mail：adljym@163.com。

基金项目：国家自然科学基金(81160470)