阿里红不同极性萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞损伤的保护作用

艾合麦提·图尔贡， 帕丽达·阿不力孜， 哈丽旦·阿布力孜， 周　昱，丛媛媛， 米仁沙·牙库甫，

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐　830011； 2第一附属医院手术室, 乌鲁木齐　830054)



·药学研究·

阿里红不同极性萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞损伤的保护作用

艾合麦提·图尔贡1， 帕丽达·阿不力孜1， 哈丽旦·阿布力孜2， 周昱1，丛媛媛1， 米仁沙·牙库甫1，

(新疆医科大学1药学院， 乌鲁木齐830011；2第一附属医院手术室, 乌鲁木齐830054)

摘要：目的研究阿里红不同极性萃取物对β-淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)诱导大鼠肾上腺嗜络瘤细胞(PC12)损伤的保护作用。方法阿里红不同极性萃取物作用于PC12细胞，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选出对PC12细胞增殖活性最强的萃取物，Aβ25-35诱导PC12细胞损伤建立阿尔茨海默病体外模型；将培养的细胞分为5组：正常对照组、模型组(Aβ25-35损伤组)、药物低剂量组(50 μg/mL)、药物中剂量组(100 μg/mL)、药物高剂量组(200 μg/mL)。采用MTT法检测PC12细胞的存活率；AinexinV-FITC/7-AAD双染法流式细胞仪检测细胞凋亡；采用RT-PCR法检测bax和bcl-2基因mRNA的表达水平。结果在阿里红不同极性萃取物中，乙酸乙酯萃取物可促进PC12细胞的增殖，差异具有统计学意义(P<0.05)；给予Aβ25-35诱导后PC12细胞存活率降低为(44.73±10.14)%，细胞凋亡率升高(19.6%)；而给予阿里红乙酸乙酯萃取物处理后，高剂量组细胞存活率升高(64.36±4.00)%，细胞凋亡率降低(6.1%)，阿里红乙酸乙酯萃取物高、中、低剂量组的细胞存活率差异有统计学意义。RT-PCR结果表明经Aβ25-35处理后细胞的bax基因表达上调，bcl-2基因表达下调；给予阿里红乙酸乙酯萃取物处理后，bax基因表达水平明显降低，bcl-2基因表达水平明显增高。结论阿里红不同极性萃取物中乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞损伤有保护作用。

关键词：阿尔茨海默病； 阿里红； PC-12细胞； β- 淀粉样蛋白

阿尔茨海默病( Alzheimer’s Disease, AD) 是常见于老年人的神经系统变性疾病，其特征性病理学改变是老年斑(SP) 、神经原纤维缠结(NFT) 和以海马皮层区域为主的神经元丢失[1]。β-淀粉样蛋白(Aβ) 是SP 的主要成份，Aβ的异常沉积是AD发病的危险因素之一。所以用Aβ25-35直接诱导PC12细胞凋亡建立AD细胞模型是目前体外进行AD研究的理想模型[2]。阿里红(Fomes officinalis Ames)为多孔菌科大型真菌药用层孔菌的干燥子实体，作为维吾尔族医的常用药物，其具有温肺祛痰、降气平喘、利尿消肿等作用，多用于治疗慢性支气管炎、腹痛、感冒、肺结核等[3]。相关研究报道阿里红子实体还具有免疫调节[4]、清除氧自由基及抗DNA氧化损伤、抗衰老、抗肿瘤及平喘祛痰等作用[5-6]。阿里红为具有潜在治疗AD的维吾尔药物。本研究拟以Aβ25-35诱导PC12细胞损伤建立AD细胞模型，通过观察细胞存活率、bax和bcl-2基因mRNA的表达水平及细胞凋亡率等相关指标，探索阿里红萃取物对神经元的保护作用及其机制，为进一步对阿尔茨海默病的研究奠定基础。

1仪器与试药

1.1仪器 SW-CJ-2F型超净台(上海值域分析仪器公司)，Benchmark PLUS型 酶标仪(美国BIO-RAD公司)，IX71-12FL/PH型荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)，离心机BR4i 型(美国Beckman公司)，流式细胞仪FACSAriall型(北京Scotsman公司)，C-MAGHS10型磁力搅拌器(中国温州医疗电器厂)，荧光定量PCR仪IQ5型(美国 ABI 公司)，二氧化碳培养箱371型(美国Thermo公司)。

1.2试药阿里红药材采自新疆阿勒泰地区小东沟乡，药材经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为阿里红(Fomes officinalis Ames.)。DMEM高糖培养液(Hy Clone公司，批号：NZL1273)，磷酸盐(PBS)缓冲液(Hy Clone公司，批号：NAF1410)，胎牛血清(FBS，上海生工生物公司，批号：NYE0873)，0.25% 胰蛋白酶(Hy Clone公司，批号：JI40040)，双抗(Hy Clone公司，批号：JI30031)，MTT(美国Sigma公司， 批号：M-2128)，Aβ25-35(美国Sigma公司，批号：054M4822V)，细胞凋亡检测试剂盒(贝博生物公司，批号：B150011)，bax和bcl-2引物为华大基因公司的Oligo合成，其他试剂均为国产分析纯。

2方法与结果

2.1阿里红提取物的制备取药材5 000 g，加8倍量的95%乙醇加热回流提取3次，每次分别为3、2、1.5 h，合并提取液，浓缩至无味，浸膏在蒸馏水中溶解，将浸膏用正丁醇、乙酸乙酯、氯仿萃取，将萃取液浓缩，蒸干，备用。

2.2细胞培养PC12细胞(由新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院提供)用含有10%胎牛血清(FBS)及双抗的DMEM 培养液，放入CO2的培养箱中培养(37℃、饱和湿度的5% CO2、95%空气)，于倒置显微镜下观察细胞生长情况，根据细胞生长情况，每 2～3天换液，用0.25%胰蛋白酶消化，按体积1∶4 传代和冻存。取对数生长期细胞进行实验。

2.3药物配置和分组称取阿里红萃取物50 mg，溶解在含DMSO(DMSO的终浓度控制在0.1%以下)的DMEM高糖培养液里(DMEM 5 mL、DMSO 100 μL)，放在电磁搅拌器上搅拌4 h，使其完全溶解，过滤除菌备用，药物最终浓度为10 mg/mL。将Aβ25-35溶于高压灭菌后的双蒸水配成浓度为11.5 μmol/L贮存液，过滤分装，-20℃冷冻保存，使用前置于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱里卵育24 h。实验分为5组：正常组加入培养液；模型组加入培养液和11.5 μmol/LAβ25-35；低剂量组加入培养液和50 μg/mL 阿里红不同极性萃取物2 h后，再加入11.5 μmol/L Aβ25-35；中剂量组加入培养液和100 μg/mL阿里红不同极性萃取物2 h后，再加入11.5 μmol/L Aβ25-35；高剂量组加入培养液和200 μg/mL阿里红不同极性萃取物2 h 后，再加入11.5 μmol/L Aβ25-35。

2.5MTT法检测细胞增殖的影响MTT 法观察阿里红不同极性萃取物对PC12细胞的增殖作用。将培养的PC12细胞，以2×104个/mL密度的细胞悬浮液接种于96孔板。在37℃、5% CO2的培养箱里培养24 h 后，阿里红不同极性萃取物进行药物干预，加入受试样品200 μL，于37℃、5% CO2的培养箱里培养24、48、72、96 h 后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL ，孵育4 h，弃去上清液，每孔加DMSO 150 μL溶解结晶，用全波长酶标仪在490 nm处测OD值。MTT法结果显示，与正常组细胞比较，阿里红乙酸乙酯萃取物对PC12细胞有增殖作用(P<0.05)，检测后续实验，结果见表1、图1。

浓度/(μg/mL)OD值乙酸乙酯萃取物粗多糖正丁醇萃取物氯仿萃取物水提物正常组0.412±0.0090.450±0.0140.720±0.0160.517±0.0890.553±0.045500.445±0.0440.300±0.024**0.510±0.059**0.375±0.109**0.335±0.059**1000.457±0.0170.302±0.025**0.457±0.027**0.377±0.089**0.185±0.036**2000.470±0.040*0.282±0.015**0.415±0.023**0.115±0.006**0.175±0.025**4000.495±0.023**0.245±0.013**0.422±0.040**0.100±0.000**0.157±0.005**6000.492±0.057**0.255±0.028**0.370±0.057**0.100±0.011**0.155±0.012**8000.505±0.036**0.202±0.035**0.427±0.022**0.105±0.006**0.152±0.018**

注： 与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.6MTT法测定细胞活性按“2.5”项下的方法将细胞接种于96孔板，对PC12细胞增殖最强的部位按上述分组方法进行药物干预，然后按“2.5”项下的方法检测细胞存活率。细胞存活率%=实验组OD值/正常组OD值×100%。MTT法检测结果显示，与正常组细胞比较，模型组(11.5 μmol/L Aβ25-35)处理后的细胞存活率明显降低(P<0.001)，存活率为(44.73±10.14)%；阿里红乙酸乙酯萃取物干预后细胞活性有所提高，高(阿里红乙酸乙酯萃取物200 μg/mL+11.5 μmol/L Aβ25-35)、中(阿里红乙酸乙酯萃取物100 μg/mL+11.5 μmol/L Aβ25-35)、低(阿里红乙酸乙酯萃取物50 μg/mL+11.5 μmol/L Aβ25-35)剂量组的细胞存活率差异具有统计学意义(P<0.001、P<0.01、P<0.05)，存活率分别为(64.36±4.00)%、(59.70±3.03)%、(53.09±3.45)%，结果见图2。

2.7流式细胞仪检测细胞凋亡按按“2.5”项下的方法细胞培养48 h后，将各组细胞用胰酶消化收集，1 000 r/ min离心5 min，细胞沉淀并用PBS缓冲液洗涤2次，采用AinexinV-FITC/7-AAD双染法，用细胞凋亡检测试剂盒内的缓冲液(9 mL蒸馏水+1 mL Buffer)100 μL重悬，室温加入Ainexin V-FITC及7-ADD各5 μL避光染色15 min，上机前补加400 μL缓冲液，1 h之内在流式细胞仪上机检测细胞凋亡的情况。 结果表明经AinexinV和7-AAD染色后，正常组的细胞凋亡率为4.5%，模型组的细胞凋亡率明显上升(19.6%)，高、中、低剂量组的细胞凋亡率分别为6.1%、10.4%、14.6%，表明阿里红乙酸乙酯萃取物能抑制Aβ25-35诱导PC12细胞的凋亡。与模型组总凋亡率相比，阿里红乙酸乙酯萃取物低、中、高剂量组总凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图3。

2.8RT-PCR检测bax和bcl-2基因表达将培养的PC12细胞，以2×104个/mL密度的细胞悬浮液细胞接种于2个6孔培养板，接种1 mL/孔、无含血清的培养基中在37℃、 5% CO2的培养箱里培养24 h，

图2　MTT法检测阿里红乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞活性的影响

表2阿里红乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡的保护作用(n=4, %)

细胞状态正常组阿里红乙酸乙酯萃取物低剂量组中剂量组高剂量组模型组UL(死亡率)3.22.43.14.02.9UR(晚期凋亡率)1.94.46.02.67.3LL(活细胞存活率)92.382.986.589.877.5LR(早期凋亡率)2.610.44.43.512.3总凋亡率4.514.610.46.119.6

待细胞完全贴壁以后，吸取培养液，然后按照上述分组方法进行药物干预48 h，然后提取总RNA。用紫外分光光度仪(A260nm/A280nm)分析总RNA的纯度，纯度范围为1.6～1.9，计算RNA含量。逆转录合成cDNA。逆转录产物cDNA加入荧光定量PCR反应体系。引物序列设计参照文献[7-8]：(1)Rat bax: (扩增长度 166 bp);Sense primer：5＇-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG-3＇;Antisense primer：5＇-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC-3＇;(2)Rat bcl-2: (扩增长度 227 bp);Sense primer：5＇-CTGGTGGACAACATCGCTCG-3＇;Antisense primer：5＇-GGTCTGCTGACCTCATTGTG-3＇;(3) Rat GAPDH: (扩增长度 517 bp，内参照)Sense primer：5＇-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3＇;Antisense primer：5＇-GAGCCCTTCCACGATGCCAA-3＇。RT-PCR结果显示，与正常组比较，模型组bcl-2基因的mRNA表达水平降低，bax基因的mRNA表达水平增高；与模型组比较，药物干预后，bcl-2基因的mRNA表达明显增高，bax基因的mRNA表达水平明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

a: 正常组凋亡图

b: 模型组凋亡图

c: 低剂量组凋亡图

d: 中剂量组凋亡图

e: 高剂量组凋亡图

(Q1: 损伤坏死细胞; Q2: 晚期凋亡细胞; Q3: 活细胞; Q4: 早期凋亡细胞)

图3流式细胞仪检测阿里红乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞凋亡的保护作用

图4　RT-PCR检测bax和bcl-2基因表达的影响

3讨论

β-淀粉样蛋白是老年斑的主要成分，大脑中Aβ的沉积和聚集是AD 发病的起始因素之一[9]。目前在AD 动物和细胞模型研究中，Aβ25-35诱导损伤是AD 模型的常用方法[10-11]。近期国内学者从传统中药中筛选治疗老年痴呆的药物, 比如银杏叶、丹参提取物以及人参皂苷等, 在临床及基础研究中取得了一定的成就[12]。PC12细胞具有肾上腺皮质细胞和交感神经细胞元的特征，作为细胞模型已被广泛应用于研究AD，因此本实验建立了Aβ25-35损伤的细胞模型, 研究阿里红不同极性萃取物对PC12细胞的保护作用及其机制。

本研究MTT检测结果表明，阿里红不同极性萃取物中，与正常组比较，阿里红乙酸乙酯萃取物对PC12细胞具有明显的增殖作用，其他部位没有增殖作用； 50、100、200、400、600、800 μg/mL浓度的阿里红乙酸乙酯萃取物对PC12细胞均有增殖作用，本实验选50、100、200 μg/mL的浓度，表明阿里红乙酸乙酯萃取物可能含有促进PC12细胞增殖的活性成分，因此本实验以阿里红乙酸乙酯萃取物作为探讨阿里红不同极性萃取物对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的保护作用；选用11.5 μmol/L Aβ25-35作用于PC12细胞构建AD 体外模型。结果表明， Aβ25-35处理后的细胞存活率明显降低，表明Aβ25-35可造成PC12细胞的毒性作用；阿里红乙酸乙酯萃取物干预后，细胞存活率增高，表明阿里乙酸乙酯萃取物可减轻 Aβ25-35引起的神经毒性作用。本研究采用AinexinⅤ及ADD-7双染流式细胞技术检测不同实验组PC12细胞的凋亡情况。结果表明Aβ25-35可引起PC12神经细胞的凋亡；阿里红乙酸乙酯萃取物干预后，PC12细胞的凋亡率下降，其中高剂量组(11.5 μmol/L Aβ25-35+200 μg/mL)的凋亡率明显下降，表明阿里红乙酸乙酯萃取物具有抑制细胞凋亡的作用，因此本实验体外模型可以作为评价阿里红乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤保护作用的AD细胞模型。

bcl-2是bcl-2家族中抗凋亡基因，bax是bcl-2家族中促凋亡基因，2种基因的表达比值是调节细胞是否发生凋亡的重要因素[13-14]。抑制细胞凋亡的bcl-2基因和促进细胞凋亡的bax基因与细胞凋亡密切相关；本实验结果表明， Aβ25-35诱导PC12细胞的凋亡，阿里红乙酸乙酯萃取物可以下调bax基因mRNA的表达，上调bcl-2基因mRNA的表达，降低Aβ25-35的毒性作用，因此达到保护神经细胞(PC12)的作用。本研究结果显示，阿里红乙酸乙酯萃取物能减少 Aβ25-35诱导的细胞凋亡，因此阿里红乙酸乙酯萃取物对Aβ25-35诱导PC-12细胞损伤具有保护作用。

参考文献：

[1]董丽华，胡国华．阿尔茨海默病的蛋白质组学研究进展[J].中国老年学杂志，2004，24(4)：124-126

[2] 傅秋黎，戴海斌，沈耀，等．组胺对β淀粉样蛋白诱导PC-12细胞阿尔茨海默病体外模型的保护作用[J].浙江大学学报，2007，36(2)：146-149.

[3]丛媛媛，阿地力· 阿不力孜，帕丽达· 阿不力孜，等．维药阿里红多糖的提取及免疫活性研究[J].中国现代应用药学，2010，27(7)：569-571.

[4]依巴代提·托乎提，玛依努尔·吐尔逊，苏巴提·吐尔地，等．阿里红多糖对氧自由基的清除作用[J].新疆医科大学学报，2006，29(1)：15-17.

[5]帕丽达·阿不力孜，如斯塔木·托合尼牙孜，丛媛媛．阿里红多糖抗衰老作用研究[J]．中华中医药杂志，2013，28(2)：340-342.

[6]张慧锋，郭淑英，申蕾，等．维吾尔药阿里红的研究现状[J].吉林医药学院学报，2014，35(5)：354-357.

[7]Michio T，Yong HC，Hideo M，et al.Tumornecrosis factor induces Bcl-2 and Bax expression through NFB activation in primary hippocampal neurons[J]. Biol Chem，1999，274: 8531-8538.

[8]Ni Y，Zhao BL，Hou J，et al.Preventive effect of Ginkgo bibba extract on apoptosis in rat cerebellar neuronal cells induced by hydroxyl radicals[J]. Neurosci Lett,1996，241: 115-118.

[9] Yu W，Mechawar N，Krantic S，et al．Evidence for the involvement of apoptosis-inducing factor-mediated caspase-independent neuronal death in Alzheimer’s disease[J]. Am J Pathol，2010,176(5): 2209-2211.

[10]杨红旗，李学，蒋秋焕，等.多奈哌齐对Aβ25-35诱导神经毒性的保护作用[J]．中华神经医学杂志，2012，11(12)： 209-301.

[11]He F，Gao YP，Che FY，et al.Inhibitory effects of edaravone in β-amyloid-induced neuro-toxicity in rats[J]. Biol Med Res Intern ，2014，4: 1-7.

[12]罩仁安，罗佳波，黄竹英，等.复方丹参片对阿尔茨海默病大鼠学习记忆障碍和脑组织β-AP含量的影响[J].中华中药杂志，2005，20(6)： 377-378.

[13]鼓华，郭洪志，赵忠新，等.阿魏酸钠对局灶性脑缺血致多器官功能障碍综合征大鼠模型脑和肺及肾 Bax和Bcl-2 表达的影响[J]．实用心脑肺血管病杂志，2007，15(1)： 10-13.

[14]袁芳，徐琦，盛磊，等.琐琐葡萄多糖对β 淀粉样蛋白诱导PC12 细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志，2015，10(35)：5372-5375.

(本文编辑施洋)

Protective effect of the extract with different polarity from Fomes officinalis Ames on PC-12 cell injury induced by Aβ25-35

Aihemati Tuergong1， Palida Abulizi1， Halidan Abulizi2， ZHOU Yu1， CONG Yuanyuan1， Mirensha Yakufu1

(1CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China;2OperationRoom,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effect of the extracts with different polarity from Fomes officinalis Ames on Rat adrenal pheochromocytoma (PC12) injury induced by the β-amyloid proteion (Aβ25-35). MethodsThe PC12 cells were processed with extracts having different polarity from Fomes officinalis Ames，PC12 cells with the highest level of proliferation were selected with MTT method；In vitro Alzheimer disease model was established on PC12 cells by Aβ25-35induction；The cell viability was measured by MTT assay；The apoptosis was detected with AinexinV-FITC/7-AAD dual staining by flow cytometry； mRNA expression level of bax and bcl-2 was detected with RT-PCR. ResultsAmong the extracts having different polarity from Fomes officinalis Ames, the ethyl acetate extract can promote the proliferation of PC12 cell. there was statistical significance (P<0.05)； Cell viability of PC12 cells after Aβ25-35inductiondecreased (44.73±10.14)% and the apoptosis rate increased(19.6%). The ethyl acetate extract of Fomes officinalis Ames could effectively alleviate the cell inhibition induced by the Aβ25-35， increasing the cell viability (64.36±4.00)% and decreasing the apoptosis rate (6.1%)；RT-PCR result showed that after the PC12 cells was induced by Aβ25-35， the bax gene expression was up-regulated whereas the bcl-2 expression was down-regulated；In the induced cells which were processed with FEA，the bax gene expression was down-regulated significantly， the bcl-2 expression was up-regulated significantly. ConclusionThe ethyl acetate extract of Fomes officinalis Ames has protective effect on cell injury induced by Aβ25-35.

Keywords：Alzheimer′s disease； Fomes officinalis Ames； PC-12 cell； Aβ25-35

[收稿日期：2016-02-01]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.012

中图分类号：R966

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0573-05

作者简介：艾合麦提·图尔贡(1989-)，男(维吾尔族)，在读硕士，研究方向：维吾尔药药效的研究。通信作者：帕丽达·阿不力孜，女(乌孜别克族)，博士，教授，博士生导师，研究方向：维吾尔药药效的研究， E-mail:palida3345@163.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C012)