CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞在泡球蚴感染小鼠中的水平变化

徐　岩, 庞楠楠, 郭忠帅, 张峰波, 向　阳, 赵　慧, 马秀敏, 丁剑冰

(新疆医科大学1基础医学院免疫教研室, 乌鲁木齐　830011; 2第一附属医院医学检验中心, 乌鲁木齐　830054)



CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞在泡球蚴感染小鼠中的水平变化

徐岩1,2, 庞楠楠2, 郭忠帅1,2, 张峰波2, 向阳2, 赵慧2, 马秀敏2, 丁剑冰1

(新疆医科大学1基础医学院免疫教研室, 乌鲁木齐830011;2第一附属医院医学检验中心, 乌鲁木齐830054)

摘要:目的研究泡球蚴(Em)感染Balb/c小鼠脾脏CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞(mDC)及白介素12、γ干扰素的水平变化，揭示树突状细胞在泡型包虫病发生中的作用与机制。方法80只健康雌性Balb/c小鼠,随机取20小鼠行感染率检测，其余60只随机分为实验组和对照组，每组30只，实验组腹腔注射活原头节悬液0.2 mL/只(约含400个原头节)，对照组腹腔注射等量生理盐水，分别于接种后2、8、30、90、180、360 d各处死5只小鼠，无菌取各组脾脏常规方法制备细胞悬液，用流式细胞术检测脾脏CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞百分含量；将脾脏DC进行纯化和培养，ELISA法检测培养上清中白介素12、γ干扰素的含量。结果(1)Em感染小鼠90 d，可见明显泡球蚴囊泡组织，感染后360 d，泡球蚴病灶遍布肝脏各叶；(2)Em感染小鼠2、8、30、90、180 d后脾脏mDC百分比显著高于对照组(P<0.01)，其中在感染2～90 d过程中缓慢上升，90 d达到峰值，之后迅速降低，至感染360 d后，脾脏mDC百分比与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；(3)Em感染小鼠脾脏DC培养上清液中IFN-γ和IL-12水平始终高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，随泡球蚴感染时间呈先上升再下降趋势，90 d达到峰值。结论泡球蚴感染早期，mDC表达水平增高，促进细胞免疫应答，介导免疫保护，在抵抗早期泡球蚴的发生和发展和清除虫体中发挥作用，泡球蚴感染中晚期，mDC表达水平降低。DC分泌的IL-12和IFN-γ随DC表达水平和功能发生变化，参与泡球蚴进入体内后的免疫过程，在增强宿主免疫力和抑制包虫生长过程中发挥重要的免疫调节作用。

关键词：泡球蚴； 树突状细胞； 脾脏

多房棘球蚴病(multilocular hydatid disease)又称泡型包虫病(alveolar echinococcosis AE)、泡球蚴病(Alveococcosis) 或多房性包虫病，是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，Em)的幼虫棘球蚴(metacestode)寄生于宿主体内而引起的一种严重的人畜共患病[1-2]。在泡球蚴感染早期，以Th1细胞介导的细胞免疫为主，通过分泌白介素2、白介素12、γ干扰素等细胞因子控制泡球蚴的生长和转移；感染中晚期转化为以Th2细胞介导的体液免疫为主，分泌白介素4、白介素5、白介素10等细胞因子，激化感染，使得泡球蚴在小鼠体内快速生长[4]。此外，在感染过程中，泡球蚴通过主动调整Th1/Th2细胞因子的平衡，既能使机体不产生严重的免疫病理损害，又能成功地逃避宿主的免疫清除作用[3-4]，实现在宿主体内长期寄生。

树突状细胞(dendritic cells DC)是由美国学者Steinman和Cohn于1973年发现的一类具有强大的活化初始T细胞能力的抗原提呈细胞，由于其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名[5-6]，是病原体入侵机体后最早遇到的细胞。DC是目前所知的功能最强的专职抗原提呈细胞，具有多种生物学活性。DC有许多种分类方法，可根据来源、分布、分化状态和功能等分为不同亚群，其中来源于髓样干细胞的髓样DC(myeloid dendritic cells，mDC)，也称DC1，表面标记为CD11C+CD45RA-，与单核细胞和粒细胞有共同的前体细胞[7]。

目前，对DC在人体病毒感染外周血中或在寄生虫早期感染中的作用研究较多，而对DC在Em感染过程中的免疫作用研究较少，对mDC在Em感染中的动态变化，国内外尚未见相关报道。本研究以Em感染Balb/c小鼠肝脏建立AE动物模型，动态观察Em感染Balb/c小鼠脾脏细胞悬液DC亚群及其脾脏DC分泌的细胞因子水平变化，探讨Em感染小鼠过程中DC亚群的表达量与病情发展的关系，以及在泡型包虫病发病中的作用及其相关机制。

1对象与方法

1.1实验动物6～8周龄雌性健康Balb/c小鼠(简称小鼠)80只，体质量 16～22 g，无特定病原体级，由新疆医科大学实验动物中心提供。经新疆医科大学动物保护伦审委员会批准 (许可证编号:A-20100920002)。

1.2动物感染模型的建立随机取20只小鼠行感染率检测；其余60只小鼠随机分为实验组和对照组，每组30只。取保种沙鼠(已人工腹腔感染泡球蚴18 w)用5号针头在实验小鼠左下腹穿刺腹腔接种泡球蚴原头蚴混悬液，0.2 mL/只，对照组每只小鼠左下腹腔注射0.9%生理盐水0.2 mL。接种100 d后，剖查感染率检测组小鼠的感染状况，感染率为100%，该批小鼠造模成功。

1.3实验动物分组将接种泡球蚴的小鼠随机分为2、8、30、90、180、360 d组共6组，每组5只，作为实验组。将接种0.9%生理盐水的小鼠随机分为感染2、8、30、90、180、360 d组共6组，每组5只，作为对照组。

1.4标本采集各组小鼠无菌取脾脏制作细胞悬液，进行CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞亚群检测。

1.5仪器和试剂BD流式细胞仪，BD红细胞裂解液，ThermoRPM-1640，小鼠IL-12 ELISA试剂盒，小鼠IFN-γELISA试剂盒。

1.6流式细胞术检测检测脾脏CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞亚群在无菌培养皿中将小鼠脾脏充分研磨，加红细胞裂解液后静置，用移液器缓慢吸出中间呈现白色云雾状的淋巴细胞层(旋转吸取)，将细胞悬起，洗涤，3 000 r/min离心 5 min，弃上清；移到流式管中，上机检测CD11C+CD45RA-髓样树突状细胞亚群，利用统计软件分析数据。

1.7ELISA法检测脾脏mDC培养上清IFN-γ以及IL-12含量采用双抗体夹心ABC-ELISA法，在492 nm处测OD值，小鼠IFN-γ、IL-12浓度与OD450值之间成正比，通过绘制标准曲线求出标本中小鼠IFN-γ、IL-12浓度。

2结果

2.1脾脏CD11C+CD45RA-mDC的动态变化Em感染小鼠2 d后，脾脏CD11C+CD45RA-mDC的表达百分比明显上升(P<0.05)，并随着泡球蚴感染时间的增加而增加，90 d 达到峰值，之后下降，至感染360 d后，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　脾脏CD11C+CD45RA-mDC水平观察表(%， ±s)

注：与对照组比较,*P<0.05。

2.2泡球蚴感染小鼠后脾脏mDC培养上清液中IFN-γ和IL-12含量的动态变化泡球蚴感染Balb/c小鼠后，脾脏DC培养上清液中IFN-γ和IL-12水平始终高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)，随泡球蚴感染时间呈先上升再下降趋势，90 d达到峰值，见表2、3。

表2　脾脏DC分泌的IL-12水平观察表(pg/mL， ±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表3　脾脏DC分泌的IFN-γ水平观察表(pg/mL， ±s)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3讨论

mDC由髓样干细胞分化而来，与单核细胞、粒细胞有共同的祖细胞。mDC的分化发育分4个阶段：前体阶段、未成熟DC(immature DC，iDC)、迁移期DC和成熟DC[8]。成熟mDC在CD40L的作用下，能分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ等Thl型细胞因子，有效地将抗原提呈给初始T细胞并使之激活，促使Th0细胞向Th1细胞分化，引发Th1反应，促进细胞介导的免疫应答[9]。在间日疟患者外周血研究中，mDC水平与对照组无明显不同[10]；在乙型肝炎病毒感染及结核病患者外周血研究中，mDC水平显著低于正常对照组[11]；在人感染疾病模型中，实验对象均为已明确诊断的病人，属后期感染[12]。本研究显示，在感染晚期(360 d)脾脏mDC与对照组相比无明显差异，这与人感染疾病模型结果相同；在泡球蚴感染早期，能在脾脏检测到大量CD11C+CD45RA-mDC表达，说明机体受泡球蚴抗原刺激后，mDC迅速分化成熟并迁移至脾脏等次级淋巴器官，抗原提呈能力增强，同时分泌细胞因子促使Th0细胞向Th1细胞分化，促进细胞免疫应答，介导免疫保护，在抵抗早期泡球蚴的发生和发展和清除虫体中发挥作用。

IL-12是一种具有免疫调节功能的生物活性介质，在机体免疫功能中发挥着十分重要的作用。新近研究表明，树突状细胞在IL-12作用下能够分泌IFN-γ，IFN-γ的存在也促进DC诱导Th1细胞产生[13]。本研究结果显示，脾脏DC分泌的IL-12水平的动态变化趋势，与感染小鼠体内泡球蚴的生长及Th1细胞免疫应答的变化模式相一致，Em感染小鼠，90 d以前虫体的生长相对缓慢，90 d以后生长迅速，说明DC通过合成和分泌IL-12等细胞因子参与泡球蚴进入体内后的免疫过程，促使Th0细胞向Th1细胞分化，诱导Th1免疫应答，且Th1免疫应答的维持依赖于IL-12的持续存在，在增强宿主免疫力和抑制包虫生长过程中发挥重要的免疫调节作用。

DC作为主要的抗原提呈细胞也具有产生IFN-γ的能力，DC产生IFN-γ的过程受到许多其他细胞因子的调控，IFN-α、IL-4、IL-10能抑制DC产生IFN-γ，而IL-12和IL-18能促进DC产生IFN-γ。已有研究证明，阻断IFN-γ信号转导途径能使DC分化发育迟缓，抗原提呈功能功能下降，继而驱使Th1应答的功能下降[14-15]。本研究结果显示，在泡球蚴感染过程中，由于脾脏和淋巴结DC表达水平和功能发生变化，导致其分泌的IFN-γ水平也发生变化。感染早期，机体免疫以mDC介导的Th1细胞免疫应答为主，分泌的IFN-γ升高，进一步调控DC分化发育，加强Th1应答效应，在杀伤虫体、抑制泡球蚴生长中发挥作用。此外，IFN-γ变化水平与IL-12水平变化基本一致，说明在IL-12作用下，促进DC产生IFN-γ，二者相互作用，在抵抗泡球蚴感染中共同发挥免疫效应。

综上所述，在泡球蚴的慢性感染过程中，树突状细胞作为一种专职性的抗原提呈细胞在抵抗泡球蚴感染过程中起着重要作用。泡球蚴抗原刺激并影响DC的分化模式和功能，感染早期，mDC表达升高，发挥主要作用，分泌细胞因子IFN-γ和IL-12，以诱导的Th1型应答为主，有利于宿主抵抗泡球蚴感染；感染中晚期，mDC表达下降，不利于宿主免疫应答，甚至发生免疫逃避，使寄生虫在宿主体内继续繁衍生长，对宿主造成极大危害。

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(本文编辑张巧莲)

The dynamic changes of CD11C+CD45RA-myeloid dendritic cells in the mice infected with echinococcus multilocularis

XU Yan1,2, PANG Nananan2, GUO Zhongshuai1,2, ZHANG Fengbo2, XIANG Yang2, ZHAO Hu2,MA Xiumin2, DING Jianbing1

(1MedicalDiagnosticCentre,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;2DepartmentofImmunology，BasicMedicalCollege，XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

Abstract:ObjectiveThe purpose of this study is to observe the dynamic changes of CD11C+CD45RA- myeloid dendritic cells (mDC) in the spleen of Balb/c mice infected with echinococcus multilocularis (E.m). The dynamic level change of IL-12, IFN-γ secretion by spleen DC might reveal the role and mechanisms of dendritic cells in E.m infection. Methods20 mice were chosen randomly from 80 healthy female Balb/c mice to detect the E.m infection rate. The other 60 mice were randomly divided into the experimental group and the healthy control group， 30 mice in each group. Mice in the experiment group were injected intraperitoneally with 0.2 mL protoscolex suspension (about 400 protoscolex)， while the mice in the control group was injected intraperitoneally with equal amount of saline. At 2 d， 8 d， 30 d， 90 d， 180 d and 360 d after injection， 5 mice was killed each time respectively in two groups. The spleen was obtained sterile for cell suspension with routine methods. Meanwhile，the count percentage of CD11C+CD45RA-mDC，in spleen were detected by flow cytometry. Results(1) E.m vesicles were initial visible at 90d after infected with E.m and in every lobe of liver at 360d；(2) The percentage of splenic mDC was distinctly higher than control group (P<0.01) at 2 d, 8 d, 30 d, 90 d, 180 d after infection. And it grew slowly through 2 d to 90 d，arrived the peak at 90 d，and then decreased quickly in the subsequent process until at 360 d. The percentage of splenic mDC in experimental group did not have obviously difference compared with control group (P>0.05). ConclusionIn the early infection stage， immunological effect mediated by mDC was dominant. It could promote immune response of cells and mediated immune protection. The mDC might play an important role in the occurrence, development and clearance in early stage of alveolar hydatid. The secretion of IL-12 and IFN-γ by DC might participate in the immune process and play an important immune regulating role in enhancing the immunity of host and inhibiting the growth of hydatid after Em infection.

Keywords：Echinococcus multilocularis； dendritic cells； spleen

[收稿日期：2015-12-12]

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2016.05.010

中图分类号：R34; R-33

文献标识码：A

文章编号：1009-5551(2016)05-0565-04

作者简介：徐岩(1986-)，女，在读硕士，技师，研究方向:寄生虫免疫。通信作者：丁剑冰，女，博士，教授，博士生导师，研究方向: 感染免疫,E-mail:djbing002@sina.com。

基金项目：新疆维吾尔自治区包虫病重点实验室开放课题(XJDX0202-2010-04); 国家自然科学基金(81460307，81160200，81060135, 81160378)