顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后对肿瘤干细胞标志物的影响*

徐颖佳,薛赢俊,陆婵娟

(1.同仁医院检验科,上海 200050;2.上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海 200333)



·论著·

顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后对肿瘤干细胞标志物的影响*

徐颖佳1,薛赢俊2,陆婵娟1

(1.同仁医院检验科,上海 200050;2.上海中医药大学附属龙华医院检验科，上海 200333)

摘要:目的研究顺铂作用于人肝癌细胞系HepG2后对肿瘤干细胞标志物的影响。方法培养HepG2人肝癌细胞,以对数生长期的细胞为研究对象,分成对照组和实验组,对照组不予特殊处理,实验组予以顺铂处理并测定细胞生长抑制率、移行愈合率,并测定相关肿瘤标记物P53、caspase-3、caspase-8、CD133、腺苷三磷酸结合盒转运体G2(ABCG2)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等的表达变化。结果细胞生长抑制率：随着药物浓度增加而增强,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞移行愈合率：实验组细胞移行愈合率明显低于对照组(P<0.05)，9 μmol/L顺铂组移行愈合率明显低于6 μmol/L顺铂组(P<0.05)。相关肿瘤标记物P53、caspase-3、caspase-8随着药物浓度增加而各指标表达增强,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光方法显示随着顺铂浓度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表达增强。结论顺铂可能通过上调肿瘤标记物P53、caspase-3、caspase-8的表达，从而抑制人肝癌细胞HepG2的生长，并抑制HepG2细胞的迁移愈合，但会使其耐药性也增加。

关键词:顺铂；肝癌；肿瘤干细胞；细胞增殖；细胞周期

原发性肝癌在我国较为常见，发病率、病死率较高[1]，大部分患者确诊时已丧失手术机会，对于这部分的肝癌患者化疗为首选治疗措施[2]。肿瘤干细胞在肿瘤增殖、转移过程中起重要作用。肿瘤干细胞具有无限增殖、分化的能力，可能具有抵抗化疗药物损伤的作用，从而导致肿瘤细胞增殖、转移。P53基因是一种抑癌基因[3]，caspase-8在细胞凋亡中起重要作用，通过激发级联反应,活化caspase-3[4]，三者在在肝癌细胞系HepG2细胞凋亡中起关键作用。本实验探讨了顺铂对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖、迁移能力的影响,在细胞水平上,通过MTT法测定细胞增殖能力,细胞划痕实验观察细胞迁移愈合能力,逆转录PCR(RT-PCR)检测P53、caspase-3、caspase-8的表达情况,细胞免疫荧光方法检测CD133、腺苷三磷酸结合盒转运体G2(ABCG2)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)等的表达，以期为肝癌的药物治疗提供借鉴。现报道如下。

1材料与方法

1.1仪器与试剂细胞培养基购于GIBCO公司;胎牛血清购自PAA公司,MTT购自Sigma公司;顺铂购自山东齐鲁制药有限公司;Trizol购自海生工生物工程技术有限公司；逆转录试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司；CD133、ABCG2、ICAM-1抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养人HepG2肝癌细胞株在37 ℃、50 mL/L CO2的环境下，在含1%青霉素和链霉素、100 mL/L的胎牛血清的培养基中培养。

1.2.2细胞增殖实验实验分为对照组和实验组，对照组不加入顺铂(空白)，实验组培养基中加入顺铂(分为3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8个浓度梯度)，每个孔中为100 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌细胞悬浊液,培养48 h后,应用MTT法检测细胞增殖的情况，记录吸光度A490值，计算细胞增殖抑制率,重复3次,求平均值。

1.2.3细胞划痕实验实验分为对照组和实验组，对照组不加入顺铂(空白)，实验组培养基中加入顺铂(分为6、9 μmol/L 2个浓度梯度)，每个孔中为600 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌细胞悬浊液。待细胞铺满板底,用无菌20 nL枪头在24孔板底部划出一条直线,每孔只划一次,加入培养基及药物后培养24 h后,测定移行愈合率：移行愈合率=(初始边缘距离-24 h后边缘距离)/初始边缘距离×100%,重复3次,求平均值。

1.2.4顺铂对HepG2细胞增殖抑制作用机制的研究细胞分为对照组和实验组，对照组为空白，实验组培养基中加入顺铂(分为5.4、10.76 μmol/L 2个浓度)，10.76 μmol/L和5.4 μmol/L分别为顺铂作用于人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h的细胞半数抑制浓度(IC50)的1/2和1/4，每个孔中为600 μL的7×104/mL的人HepG2肝癌细胞悬浊液,待细胞铺满板底,加入药物，培养48 h,提取细胞总RNA，鉴定P53、caspase-3、caspase-8等相关RNA的纯度和分析浓度，合成cDNA，电泳分析PCR产物。

1.2.5HepG2肿瘤干细胞标记物的检测实验分组分为对照组和实验组，对照组为空白，实验组加入顺铂(分为5.4、10.76 μmol/L 2个浓度)，随后的操作和1.2.4相同,培养48 h后用细胞免疫荧光方法检测CD133、ABCG2、ICAM-1的表达。

2结果

2.1细胞增殖能力的测定单独运用3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8个浓度梯度的顺铂作用于人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h后，测定A490值，计算细胞增殖抑制率。各处理组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。顺铂对人肝癌HepG2肿瘤干细胞有抑制增殖的作用，IC50时的顺铂浓度为21.52 μmol/L，药物抑制作用随着顺铂浓度的增加而增强，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　　顺铂作用于HepG2细胞48 h后对细胞增殖的

-：该项无数据。

2.2顺铂对HepG2细胞迁移的影响测定移行愈合率的比较，实验组(2个浓度)与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组移行愈合率明显低于对照组。6和9 μmol/L两个浓度组比较,差异有统计学意义(P<0.05)，9 μmol/L顺铂组移行愈合率明显低于6 μmol/L顺铂组。见表2。

表2　　不同浓度顺铂的作用下HepG2细胞移行愈合率的

2.3顺铂对HepG2细胞增殖的抑制作用机制计算实验组条带的光密度值与相应的内参光密度值的比值然后与对照组进行比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，顺铂组caspase-3、caspase-8、P53表达水平上调。见表3。

表3　　顺铂对HepG2细胞P53、caspase-3、caspase-8表达

2.4顺铂对人肝癌细胞株HepG2肿瘤干细胞标志物的影响细胞免疫荧光方法示，随着顺铂浓度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表达增强，因此可知，顺铂刺激了肿瘤干细胞耐药性的增加。

3讨论

顺铂具有广谱的抗肿瘤作用，影响肿瘤细胞代谢周期，促进其凋亡，有抑制肿瘤细胞增殖的作用。原发性肝癌在我国较为常见，发病率、病死率较高，首选的治疗措施是手术切除,但本病发病隐匿，发现时已属晚期，出现肿瘤细胞播散和远处转移，已丧失手术机会，对于这部分的肝癌患者化疗为首选措施，所以顺铂被常用于肝癌的化疗。肿瘤干细胞在肿瘤增殖、转移过程中起重要作用，肿瘤干细胞具有无限增殖、分化的能力，可能具有抵抗化疗药物损伤的作用，从而导致肿瘤细胞增殖转移，在肿瘤增殖、分化中P53、caspase-3、caspase-8的表达起到重要作用[5-7]。本实验探讨了顺铂对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖、迁移能力的影响。在细胞水平上,通过MTT法测定细胞增殖能力,细胞划痕实验观察细胞迁移愈合能力,RT-PCR检测P53、caspase-3、caspase-8的表达情况。实验中用3、6、9、12、15、18、24、30 μmol/L 8个浓度的顺铂分别作用于人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h后，测定A490值、细胞增殖抑制率，发现顺铂对人肝癌HepG2肿瘤干细胞有抑制增殖的作用，药物抑制作用随着顺铂浓度的增加而增强。顺铂的IC50为21.52 μmol/L。6和9 μmol/L浓度的实验组与对照组比较，实验组的移行愈合率明显低于对照组;6和9 μmol/L浓度下的实验组比较,高浓度顺铂组移行愈合率明显低于低浓度的顺铂组。顺铂作用于HepG2细胞48 h使caspase-3、caspase-8、P53表达水平上调可能是其抑制细胞增殖的机制。CD133是肿瘤干细胞的广谱标志物之一，ABCG2是肿瘤细胞逃避药物作用的标志物之一，ICAM-1是一细胞黏附分子，在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，细胞免疫荧光方法显示：随着顺铂浓度的增加，CD133、ABCG2、ICAM-1的表达增强，因此可知，顺铂刺激了肿瘤干细胞耐药机制的加强。

综上所述，顺铂作用于肝癌HepG2肿瘤干细胞后，可能通过上调肿瘤标记物P53、caspase-3、caspase-8表达，从而抑制人HepG2肝癌细胞的生长，并抑制人HepG2肿瘤细胞的迁移愈合，且随着药物浓度增加而抑制作用增强。但是顺铂在应用于肝癌患者后普遍出现耐药现象，对于其耐药机制的研究还有待于进一步完善[8-10]。

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The effects of cisplatin on cancer stem cell markers of hepatocellular carcinoma cell line HepG2*

XuYingjia1,XueYinjun2,LuChanjuan1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,TongrenHospital，Shanghai200050,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,LonghuaHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200333,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of cisplatin on the expression of tumor stem cell markers in human hepatoma cell line HepG2.MethodsThe cultured human hepatoma HepG2 cells in logarithmic growth phase were used for the study,which were divided into control(no special treatment was administrated) and experimental groups(cisplatin was added),then the rates of cell growth inhibition,transitional healing rates and changes in tumor associated markers associated P53,caspase-3,caspase-8，CD133，adenosine triphosphate-binding cassette superfamily G member 2(ABCG2)，intercellular cell adhesion molecule-1(ICAM-1) were measured.ResultsComparison of cell growth inhibition:with the increase of drug concentration increased,compared with the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).Transitional healing rate:with the increase of drug concentration,compared with the control group,the difference was statistically significant(P<0.05).The expression of related tumor markers P53,caspase-3,caspase-8 increased while the drug concentrations increase and were higher in the control group(P<0.05),the difference were statistically significant.In the immunofluorescence for the detection of CD133,ABCG2,ICAM-1,the fluorescence intensity increased with the concentrations of cisplatin.ConclusionCisplatin could inhibit the growth of tumor cells by up-regulating the tumor markers such as P53,caspase-3 and caspase-8.The migration of tumor cells in cell scratch test could also be inhibited by cisplatin while their drug resistance were enhanced.

Key words:cisplatin;liver cancer;cancer stem cells;cell proliferation;cell cycle

(收稿日期：2015-12-25)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.003

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)08-1023-03

基金项目：上海市药学会医院药学科研基金(2012-YY-01-02)。

作者简介：徐颖佳，女，检验师，主要从事免疫分子生物学方面的研究。