硒对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

刘　勇， 徐天娇， 霍金莲， 田永青, 李海荣， 曹向宁， 黄　瑞， 王伟伟(延安大学咸阳医院老年病科，咸阳　7000；西安医学院基础医学部药理学研究室； 通讯作者，E-mail:xtj8@63.com)



硒对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

刘勇1， 徐天娇2*， 霍金莲1， 田永青1, 李海荣1， 曹向宁1， 黄瑞1， 王伟伟1(1延安大学咸阳医院老年病科，咸阳712000；2西安医学院基础医学部药理学研究室；*通讯作者，E-mail:xtj1118@163.com)

摘要：目的观察硒对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，探讨硒诱导肺癌细胞凋亡的机制。方法设不同浓度硒(1,5,10 μmol/L)处理实验组和一个阴性空白对照组，采用MTT法检测细胞抑制率；FCM仪分析细胞的凋亡率；Western blot法检测凋亡相关分子Bcl-2,Bcl-xL,Bax,细胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表达变化。结果与24 h组比较，同浓度(5 μmol/L和10 μmol/L)硒处理48 h组和72 h组显著抑制细胞增殖(P<0.05)，且具有时间依赖性；与同时间对照组比较，硒能够明显抑制细胞增殖(P<0.05)，且具有浓度依赖性。与对照组比较，硒能够显著性诱导细胞凋亡(P<0.05)，降低Bcl-2,Bcl-xL的表达并增加Bax,cytochrome C和caspase-3的表达(P<0.05)，且均具有浓度依赖性。结论硒通过调控Bcl-2，Bax，细胞色素C及caspase-3的表达诱导A549细胞凋亡。

关键词：硒；肺腺癌;A549细胞；细胞凋亡

从肿瘤细胞学方面来说，肺癌的发生与细胞增殖及细胞凋亡之间的平衡被打破有关，凋亡过程受阻及恶性细胞无限增殖可导致肺癌发生。Bcl-2基因家族是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中两类典型的抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白。这些因子的激活、过度表达或失活是肿瘤形成的重要机制。因此，通过调控这些凋亡相关蛋白的表达而诱导肿瘤细胞凋亡可能成为抗肿瘤治疗最有效的途径之一。

目前大多数研究表明硒具有防癌、抗癌作用[1-3]。硒对于不同肿瘤的作用效果和机制却不尽相同，但诱导细胞凋亡是其发挥抗肿瘤作用的主要机制之一。本实验以人肺癌A549细胞为研究对象，观察不同浓度硒处理后细胞增殖和凋亡情况，并重点观察与凋亡相关的重要分子Bcl-2、Bcl-xL、Bax细胞色素C(cytochrome C)及caspase-3表达变化。深入探讨硒可能通过线粒体途径并依赖于caspase-3激活诱导A549细胞凋亡，为肺癌的研究提供更多实验依据。

1材料与方法

1.1主要试剂

亚硒酸钠、胰蛋白酶、牛血清白蛋白和NC膜购自美国Sigma公司；DMEM(高糖)、胎牛血清购自美国Thermo Fisher公司；二甲基亚砜(DMSO)购自上海生物化学试剂公司； BCA蛋白定量试剂购自美国Pierce公司；所有抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养

常规复苏A549细胞，用含10% FBS(胎牛血清)、100 /ml 青霉素以及100 g/ml 链霉素的DMEM(高糖)培养液培养细胞，37 ℃、5%CO2恒温箱中进行培养，间隔1-2 d换培养液1次。每2-3 d以0.25%胰酶消化，按1∶3传代。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3MTT法测定硒对A549细胞增殖的影响

取对数生长的细胞株分别以1.0×105/ml加入96孔板中培养24，48，72 h，实验组设置不同浓度：1，5，10 μmol/L；空白组加入等体积的DMSO。在每孔加入MTT，作用4 h加入DMSO孵育30 min，在490 nm处测定吸光度。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。

1.4流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI双染色法检测细胞凋亡

取对数生长期的A549细胞，以不同浓度硒(1，5，10 μmol/L)培养72 h，收集细胞，调整细胞密度为1.0×106/ml，用Annexin Ⅴ/PI双染色法处理，流式细胞仪检测A549细胞凋亡情况。

1.5Western blot检测凋亡相关蛋白

取对数生长期的A549细胞，以不同浓度硒(1，5，10 μmol/L)培养72 h，消化细胞，离心，冰浴PBS洗3次。收集细胞，加入RIPA细胞裂解液、BCA法定量蛋白，SDS-PAGE分离蛋白，并将蛋白电转移至PVDF膜上，再用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h；分别加一抗Bcl-2(1∶200)、Bcl-xL(1∶200)、Bax(1∶200)、细胞色素C(1∶200)、caspase-3(1∶200)及β-actin(1∶1 000)，4 ℃过夜；洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温轻摇1 h，充分洗涤后与ECL反应，即刻与X线片曝光，目的条带使用分析仪进行分析。

1.6统计学分析

2结果

2.1硒对A549细胞增殖的影响

不同浓度硒(1，5,10 μmol/L)对A549细胞的增殖均具有抑制作用，且具有一定浓度依赖性(见表1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L两个浓度的硒对A549细胞增殖抑制较明显，与对照组及同一浓度不同时间组比较具有统计学差异(P<0.05)。

2.2硒对A549细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示：A549细胞经1，5，10 μmol/L硒处理48 h，细胞凋亡比例呈现浓度依赖性增加(见图1)，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒处理组与对照组具有统计学差异(P<0.05)。

图1　流式细胞术检测不同浓度硒对A549细胞凋亡的影响Figure 1　Effects of selenium on apoptosis of A549 cells by FCM

组别24h48h72hODIR(%)ODIR(%)ODIR(%)对照组1.104±0.0100 1.113±0.03201.109±0.03401μmol/L组1.001±0.0439.30.984±0.02111.50.964±0.03113.15μmol/L组0.745±0.030*32.50.651±0.051**△41.50.533±0.062**△51.910μmol/L组0.643±0.041**41.80.427±0.037**△61.60.319±0.048**△71.2

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；同组与24 h比较，△P<0.05

2.3硒对A549细胞Bcl-2、Bcl-xL、Bax和细胞色素C表达的影响

1， 5,10 μmol/L硒作用于A549细胞48 h，硒能够减少Bcl-2和Bcl-xL的表达，同时增加细胞中Bax、细胞色素C和caspase-3的表达，且均具有浓度依赖性(见图2-6)。其中5 μmol/L and 10 μmol/L硒处理组与对照组有显著性差异(P<0.05)。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 图2　不同浓度硒对A549细胞Bcl-2表达的影响Figure 2　The effects of selenium on Bcl-2 expression in A549 cells

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图3　不同浓度硒对A549细胞Bcl-xL表达的影响Figure 3　The effects of selenium on Bcl-xL expression in A549 cells

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图4　不同浓度硒对A549细胞Bax表达的影响Figure 4　The effects of selenium on Bax expression in A549 cells

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01图5　不同浓度硒对A549细胞细胞色素C表达的影响Figure 5　The effects of selenium on level of cytochrome C in A549 cells

与对照组比较，*P<0.05， **P<0.01图6　不同浓度硒对A549细胞caspase-3表达的影响Figure 6　The effects of selenium on caspase-3 expression in A549 cells

3讨论

肺癌是一种发病率及死亡率极高的恶性肿瘤，对人类健康的危害日益严重。尽管采用了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但5年存活率尚不足15%。21世纪，肺癌仍然是全球恶性肿瘤患者死亡的主要原因。现已明确，细胞凋亡机制在肿瘤发生发展中具有重要意义[4]。许多抗肿瘤的药物都是通过诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞[5,6]。

硒是人和动物的必需微量元素，有着广泛的生物学效应。周岚等[7]检测了宣威女性肺癌患者癌组织、癌周组织、正常肺组织和血清硒含量，结果提示宣威地区女性肺癌的发生与低血硒状态有关，肺组织低硒可能是导致癌变的潜在危险因素。赵秀香等[8]和Klarod等[9]的研究也表明肺癌患者血清硒含量明显低于正常对照组，并且进展期肺癌患者血清硒又明显低于早期患者。这些表明，血清硒水平与肺癌发生有着密切的关系，硒缺乏会增加癌症的发生率。

本研究首先通过MTT实验观察到5 μmol/L和10 μmol/L硒能够显著性抑制A549细胞增殖活力。另外，流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI双染色法结果显示：不同浓度硒能够诱导A549细胞凋亡，其中5 μmol/L和10 μmol/L硒能够显著性诱导A549细胞凋亡，这些说明硒能够显著诱导A549细胞凋亡。

线粒体凋亡途径是细胞凋亡的主要途径之一，Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的重要因子[10]，与肿瘤的发生发展密切相关[11]。在哺乳动物细胞中，Bcl-2家族分成两类包括凋亡抑制因子和促凋亡因子。其中抑制因子包括Bcl-2、Bcl-xl等，而促凋亡因子包括Bax、Bid等。激活的Bax蛋白能够增加线粒体膜通透性使细胞色素C从线粒体释放，再与结合同时激活caspase导致细胞凋亡[12]。caspase-3是细胞凋亡的关键执行者，其活化是凋亡进入不可逆转的标志。

本研究结果显示，经硒处理后的A549细胞中促凋亡分子Bax表达增加而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl表达下降，并且胞质中cytochrome C表达显著性增加。本实验结果还显示，硒能够显著增加活化的caspase-3的表达。

通过以上实验结果我们推断：硒可能通过调控的Bcl-2及Bax表达，促进细胞色素C的释放，并激活Caspase-3，最终通过线粒体途径诱导A549细胞凋亡。

参考文献：

[1]Karelia N,Desai D,Hengst JA,etal.Selenium-containing analogs of SAHA induce cytotoxicity in lung cancer cells[J].Bioorg Med Chem Lett,2010,20(22):6816-6819.

[2]Selenius M,Fernandes AP,Brodin O,etal.Treatment of lung cancer cells with cytotoxic levels of sodium selenite:effects on the thioredoxin system[J].Biochem Pharmacol,2008,75(11):2092-2099.

[3]Fabregat I.Dysregulation of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].World J Gastroenterol,2009,15(5):513-520.

[5]Burz C,Berindan-Neagoe I,Balacescu O,etal.Apoptosis in cancer:key molecular signaling pathways and therapy targets[J].Acta Oncol,2009,48(6):811-821.

[6]Romanowska M,Kikawa KD,Fields JR,etal.Effects of selenium supplementation on expression of glutathione peroxidase isoforms in cultured human lungadenocarcinoma cell lines[J].Lung Cancer,2007,55(1):35-42.

[7]周岚，黄云超，王竹，等.宣威地区肺癌患者血清和肺组织硒水平研究[J].中国肺癌杂志，2011，14(1)：39-42.

[8]赵秀香,孟宪春,王进鸿.肺癌患者血清硒含量的研究[J].微量元素与健康研究，2001，18(3):25.

[9]Klarod K,Hongsprabhas P,Khampitak T,etal.Serum antioxidant levels and nutritional status in early and advanced stage lung cancer patients[J].Nutrition,2011,27(11-12):1156-1160.

[10]Vander Heiden MG,Thompson CB.Bcl-2 proteins:regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis[J].Nat Cell Biol,1999,1(8):E209-216.

[11]Lessene Q,Czabotar PE,Colman PM.BCL-2 family antagonists for cancer therapy[J].Nat Rev Drug Discov,2008,7(12):989-1000.

[12]Li P,Nijhawan D,Budihardjo I,etal.Cytochrome C and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade[J].Cell,1997,91(4):479-489.

Effects of selenium on proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma cell line A549 cells

LIU Yong1, XU Tianjiao2*, HUO Jinlian1, TIAN Yongqing1, LI Hairong1, CAO Xiangning1, HUANG Rui1, WANG Weiwei1

(1DepartmentofGeratology,XianyangHospitalofYan’anUniversity,Xianyang712000,China;2DepartmentofPharmacology,Xi’anMedicalUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:xtj1118@163.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of selenium on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma cell line A549 cells and explore its mechanisms.MethodsThe A549 cells were treated with different concentrations of selenium(1,5,10 μmol/L) for 24 h and 48 h respectively, and the untreated cells were used as negative contols. The cell proliferation was measured using MTT, the cell apoptosis was measured by flow cytometry and the expression of Bcl-2, Bcl-xL, Bax, cytochrome C and caspase-3 was examined by Western blot.ResultsCompared with 24 h group, the proliferation was significantly inhibited after treated with the same concentration of selenium(5,10 mol/L) in 48 h group and 72 h group(P<0.05). Selenium significantly inhibited the proliferation in a concentration-dependent manner at the same time(P<0.05). Selenium significantly induced the apoptosis (P<0.05), markedly down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-xL and up-regulated expression of Bax, CytochromeC and Caspase-3 in a concentration-dependent manner(P<0.05).ConclusionSelenium can induce the apoptosis of A549 cells by regulating the expression of Bcl-2, Bax, cytochrome C and caspase-3.

Key words:selenium;lung adenocrcinoma;A549 cell;cell apoptosis

[收稿日期：2015-09-06]

作者简介：刘勇，男，1976-10生，硕士，主治医师，E-mail:15991883311@163.com.

中图分类号：R734.2

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-0031-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.008

基金项目：陕西省教育厅科研计划基金资助项目(15JK1633)