大孔树脂纯化黄刺玫果中总黄酮的工艺研究

王晓梅， 卫　罡， 杨官娥， 王进东(山西医科大学药学院，太原　03000； 山西省医药与生命科学研究院；通讯作者，E-mail:8443838@qq.com)



大孔树脂纯化黄刺玫果中总黄酮的工艺研究

王晓梅1， 卫罡2， 杨官娥1， 王进东2*(1山西医科大学药学院，太原030001；2山西省医药与生命科学研究院；*通讯作者，E-mail:844381238@qq.com)

摘要：目的研究大孔树脂分离纯化黄刺玫果中总黄酮的工艺条件及参数。方法采用静态吸附解吸法考察8种大孔树脂对黄刺玫果中总黄酮的吸附和解吸性能，筛选树脂型号；以总黄酮的含量为指标考察各因素对D101大孔树脂纯化黄刺玫果中总黄酮的影响。结果选用D101型大孔吸附树脂，最佳工艺条件为：上样液料液比为1∶12，最大上样量为2.6 g生药/g树脂，用3BV的 70%乙醇进行洗脱，解吸率达95%，总黄酮回收率为72%。经上述工艺纯化后黄刺玫果提取物中总黄酮含量为24.87%。结论该方法简单可行，分离效果好，可为工业生产提供参考。

关键词：黄刺玫果；总黄酮；大孔树脂；纯化工艺

黄刺玫(Rosaxanthinalindl)属于蔷薇科蔷薇属蔷薇亚属野生落叶直立灌木，其成熟果实呈紫褐色或黑褐色。王常青对小鼠经口灌胃急性毒性实验结果表明，黄刺玫果汁(DXG)安全无毒[1]。抗衰老作用实验研究表明，黄刺玫果汁能明显延长果蝇寿命，降低大鼠血浆过氧化脂质(LPO)含量，并使血液中超氧化物歧化酶[2](SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力显著提高[3]。黄刺玫果实除含有维生素B和维生素C及铁、铜、锌、锰等微量元素外[3]，还含有丰富的黄酮类化合物[4]。研究表明，多数植物药中所含的黄酮类化合物有抗心脑血管疾病、抗癌抗肿瘤、抗炎镇痛和免疫调节作用及抗氧化、抗衰老作用[5]。本实验选取8种大孔树脂[6]，通过静态吸附与解吸筛选出相对较优的大孔树脂；以总黄酮的含量为指标，考察黄刺玫果提取液在大孔树脂分离纯化中的最佳上样量和洗脱条件，优选出大孔树脂分离纯化黄刺玫果中总黄酮的工艺条件，为黄刺玫果的进一步开发利用提供实验依据。

1材料、试剂与仪器

黄刺玫果采摘自山西左权县。主要试剂：芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所，无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯，8种大孔吸附树脂NKA-9、FL-1、FL-2、FL-3、DM130、AB-8、HPD100、D101均购自天津欧瑞生物科技有限公司。

仪器设备：UV-6100S型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，RE52CS-1旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，B-260型恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，DLSB-低温冷却循环泵(杭州瑞佳精密科学仪器有限公司)。

2方法与结果

2.1黄刺玫提取液的制备

取黄刺玫干果50 g，粉碎，加500 ml 70%乙醇，在80 ℃下回流提取3次，每次1.5 h，过滤，合并滤液。用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，用水补至600 ml (料液比1∶12)。离心15 min，转速为4 000 r/min，得到料液比为1∶12的供试液，备用。

2.2黄刺玫果中总黄酮含量测定方法

2.2.1标准曲线的绘制精密称取经120 ℃干燥至恒重的芦丁对照品20 mg，置于50 ml容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液备用。精密吸取芦丁对照品溶液0.5，1，1.5，2，3，4 ml，分别置于25 ml容量瓶中，加无水乙醇至总体积为6.0 ml。分别加入5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min；分别再加入10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min；分别加入1 mol/L氢氧化钠溶液10 ml，摇匀，加30%乙醇至刻度，放置15 min。在500 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程A=12.523C+0.004 9，R2=0.999 8，在8.012-64.096 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.2样品测定取2.1项下黄刺玫提取液1 ml按2.2.1中方法测定吸光度。按回归方程计算得50 g黄刺玫果的乙醇提取液中总黄酮含量为768.82 mg。

2.3大孔树脂的筛选

采用静态吸附法，通过测定吸附残液中总黄酮的含量来计算吸附量和解吸量以筛选合适的树脂。取处理好的8种大孔树脂NKA-9、FL-1、FL-2、FL-3、DM130、AB-8、HPD100、D101各3 g，放入250 ml的锥形瓶中，各加入144 ml(相当于含12 g生药)黄刺玫果提取液，每10 min振摇20 s，持续2 h，静置24 h滤过，用蒸馏水冲洗树脂，洗液合并到滤液中，于500 nm处测定吸附后滤液中总黄酮浓度。树脂用95%乙醇洗脱，每10 min振摇20 s，持续2 h，静置24 h滤过，测定解吸后滤液中总黄酮的浓度。按下列公式计算吸附率和解吸率:

吸附量=上样液浓度×上样液体积-流出液浓长×流出液体体积;

吸附率=吸附量/上样液中总黄酮量;

解吸率=洗脱液中总黄酮含量/吸附量。

由表1可知，不同类型的大孔树脂对黄刺玫果中总黄酮的吸附解吸效果差异明显，由吸附量和解吸量可以看出，吸附解吸效果最好的是NKA-9树脂，其次为FL-3型，效果最差的是FL-2型，NKA-9、FL-3、HPD100、AB-8和D101五种弱极性或非极性树脂最终解吸量差异不大，综合考虑成本等多方面因素，最终选择较为常用的D101型大孔吸附树脂作为分离纯化黄刺玫果总黄酮的适宜树脂，做进一步考察。

表1不同树脂类型的筛选结果

Table 1Static adsorption and desorption performance of different resins for total flavonoids fromRosaxanthinalindl

树脂类型 极性吸附量(mg)吸附率(%)解吸量(mg)解吸率(%)NKA-9极性 55.9747.4147.8585.50FL-1强极性63.9554.1828.6644.81FL-2中极性28.0623.7712.8645.84FL-3弱极性55.4146.9446.6584.20DM130弱极性47.7440.4441.6287.19AB-8弱极性55.2946.8444.8081.03HPD100非极性54.3346.0245.2883.34D101非极性53.7345.5244.7183.21

2.4纯化工艺参数的考察

2.4.1上样液浓度取4份黄刺玫果提取液，每份300 ml，减压回收乙醇后加水至料液比分别为1∶6,1∶8,1∶10,1∶12，以4 000 r/min离心15 min，在500 nm处分别测4份上样液中的总黄酮含量，与黄刺玫果提取液中总黄酮含量进行比较，计算不同浓度的浓缩液中总黄酮的含量以及回收率。由表2可知，浓度为1∶12时，回收率达97.9%，损失较少。所以选取料液比1∶12。

2.4.2最大上样量将处理好的D101大孔树脂滤干，称取8份，每份5 g，分别放入250 ml的具塞锥形瓶中，分别加入含有1，2，4，8，13，14，16，18 g生药的刺玫果提取液，每10 min摇20 s，持续2 h静置24 h，抽滤，用200 ml 95%的乙醇进行解吸，每10 min摇20 s，持续2 h静置24 h，抽滤，分别测定上样液、水洗液和解析液中总黄酮的含量，进而计算各溶液中总黄酮吸附率，结果见图1。

表2不同料液比下的回收率

Table 2The recovery of total flavonoids fromRosaxanthinalindlunder different concentration ratio

图1　D101树脂的吸附率随上样量的变化曲线Figure 1　The adsorption rate of D101 resin under the different sample weight

由图1可看出，吸附率随着上样量的增加而减小，超过13 g生药量时，渐渐趋于稳定，继续增加上样量，树脂吸附饱和而不再吸附，因此确定13 g生药量/5 g树脂作为最大上样量。

2.4.3洗脱液浓度取吸附好的树脂4份，每份20 g，用1BV蒸馏水洗柱，再分别用6BV 30%，50%，70%，90%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定上样流出液和乙醇洗脱液中总黄酮含量，按下列公式计算回收率:回收率=洗脱液中总黄酮含量/上样液中总黄酮含量。

由表3可知，洗脱率随着乙醇浓度的增大而增加，70%时，洗脱率和回收率都达到最高。因此选用70%的乙醇作为洗脱液。

表3乙醇浓度对总黄酮含量的影响

Table 3Effect of different ethanol concentrations as elution fluid on adsorption

乙醇浓度吸附量(mg)洗脱率(%)回收率(%)30%215.861.147.950%238.275.665.570%209.895.172.590%216.061.248.1

2.4.4洗脱终点的确定取吸附好的树脂20 g，先用1BV蒸馏水洗柱，再用70%的乙醇洗脱，按柱床体积收集，共收集6个洗脱份，测定每个洗脱份的总黄酮量。以洗脱液中总黄酮含量对洗脱体积做曲线，结果见图2。

图2　乙醇用量对总黄酮含量的影响Figure 2　The effect of dosage of ethanol on the content of total flavonoids

由图2可知，3BV的70%乙醇几乎把树脂上吸附的总黄酮全洗脱下来，故确定3BV作为洗脱体积。

2.5验证试验

通过对树脂纯化黄刺玫果中总黄酮工艺参数的考察，最终得到最佳工艺条件为：提取液减压回收乙醇，加水至料液比1∶12，4000 r/min离心15 min，弃去沉淀，取上清液按每克D101型大孔树脂上样2.6 g生药的比例上样，蒸馏水洗1BV后，以3BV的70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液。我们按照上述方法开展了验证试验，取含52 g生药量的提取液上样，测得上样液、上样流出液、洗脱液中总黄酮的含量分别为302.08 mg,76.38 mg,213.45 mg，计算解吸率为94.57%，回收率达70.66%，将洗脱液减压浓缩得到浸膏，真空干燥后用70%乙醇溶解，并测定其中总黄酮的含量，最后所得浸膏中总黄酮含量为24.87%，表明大孔树脂纯化黄刺玫果总黄酮的方法可行。

3讨论

不同类型的大孔吸附树脂由于其本身极性、孔径大小、比表面积的不同而使它们对于同一物质的吸附能力和解吸能力不同，最终影响吸附效果。由表1可以看出，FL-1型大孔树脂吸附能力最强，但吸附在树脂上的成分不易洗脱而使解吸效果最差；DM130型大孔树脂解吸能力相对较强，但其吸附能力较差；FL-2型树脂吸附和解吸效果均较低；NKA-9、FL-3、HPD100和D101型树脂的吸附、解吸效果效果均较好，吸附率相差在0.12%-1.89%之间，解吸率相差在0.13%-2.49%之间，差别不大；D101型大孔树脂在分离纯化总黄酮方面应用广泛，效果较好，综合考虑最终选取D101大孔树脂为分离纯化黄刺玫果中总黄酮的最适宜树脂。

上样液浓度直接影响整个树脂纯化工艺的效果，上样液浓度过大，易堵塞树脂柱；上样液浓度过小，在中试试验和工业生产中会大大增加时间成本，不实用。本文对不同浓度的上样液进行考察，由表2可知，料液比为1∶6，1∶8，1∶10时，上样液中总黄酮的损失较大；料液比为1∶12时，总黄酮损失量为2.1%，且溶液无明显沉淀；继续减小料液比，总黄酮含量增加很少，上样时间会大大增加，故没有考察更小浓度的上样液。

本文通过静态试验，以吸附率和解吸率为考察指标，综合考虑降低成本及适合工业化生产等因素，从8种树脂中筛选出D101大孔吸附树脂作为分离纯化黄刺玫果中总黄酮的最适宜树脂。在此基础上，通过总黄酮的损失量确定了上样液的料液比，通过动态试验对洗脱剂乙醇的浓度和用量进行了考察。确定最佳纯化工艺为：上样液料液比为1∶12，最大上样量为2.6 g生药/g树脂，乙醇洗脱浓度为70%，乙醇用量为3BV，解吸率平均达94.57%。未经大孔树脂纯化的黄刺玫果中总黄酮含量是1.548%，经D101大孔树脂纯化后的提取物中总黄酮含量可以达到24.87%。通过验证试验证明本试验优化的大孔树脂纯化工艺简单可行，为黄刺玫果总黄酮的工业化生产提供了理论依据。

参考文献：

[1]王常青，李宁，段光明，等.黄刺玫果实原汁的毒性研究[J].中国公共卫生学报，1994，13(5)：320.

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Study on the separation and purification of flavonoids fromRosaxanthinalindlwith macroporous adsorption resin

WANG Xiaomei1, WEI Gang2, YANG Guane1, WANG Jindong2*

(1CollegeofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China；2ShanxiInstituteofMedicineandLifeScience;*Correspondingauthor,E-mail:844381238@qq.com)

Abstract：ObjectiveTo optimize the process conditions of separation and purification of total flavonoids from Rosa xanthina lindl with macroreticular adsorption resin.MethodsStatic adsorption and desorption performance of eight kinds of macroporous adsorption resins for total flavonoids from Rosa xanthina lindl were investigated to screen the optimal resin. The factors of D101 macroporous resin were investigated to purify the total flavonoids of Rosa xanthina lind, with the content of total flavonoids as the index.ResultsD101 macroporous adsorption resin was chosen as the optimal resin, and its optimized technology conditions were as following:the concentration of sample solution 1∶12, the largest sample weight of 2.6 g Rosa xanthina lindl/g resin, the volume of 70% ethanol(3BV)as the eluant. The desorption rate reached 95%, and the recovery rate of total flavonoids from Rosa xanthina lindl was 72%.After purified with D101 macroporous resin, the purity of total flavonoids was up to 24.87%. ConclusionThis procedure is good and simple, and could be used to separate and purify the total flavonoids from Rosa xanthina lindl.

Key words:fruit of Rosa xanthina lindl;total flavonoids;macroporous adsorption resins;purification technology

[收稿日期：2015-10-28]

作者简介：王晓梅,女，1990-04生，硕士,E-mail:SDxiaomeiwang@163.com.

中图分类号：TQ460.6

文献标志码：A

文章编号：1007-6611(2016)01-0055-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.013

基金项目：山西省国际科技合作项目(2014081049-2)