吡非尼酮对UUO大鼠整合素连接激酶表达调控机制①

刘喜凤，康晓明，丁兰兰，李　丽，梅　梅，李慧玲

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江佳木斯154003)



吡非尼酮对UUO大鼠整合素连接激酶表达调控机制①

刘喜凤，康晓明，丁兰兰，李丽，梅梅，李慧玲

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:探究吡非尼酮(PFD)在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠中的作用及其对整合素连接激酶(ILK)表达的影响。方法: Wistar雄性大鼠72只，随机分为3组:正常组、UUO模型组和治疗组，每组24只。治疗组给予吡非尼酮500mg/kg·d(溶解在1%羟甲基纤维素钠溶液中)灌胃，正常组和UUO模型组给予等量1%羟甲基纤维素钠灌胃。各组大鼠在实验的第3、7、14天分批处死，每次各处死8只，取左肾石蜡包埋，进行HE、Masson染色，同时免疫组化检测各组大鼠ILK的表达情况。结果:与正常组对应时间点相比，UUO模型组肾小管间质损伤和纤维化程度加重，ILK表达增多，差异有统计学意义(P＜0.05) ;与UUO模型组对应时间点相比，治疗组大鼠肾小管间质损伤和纤维化程度减轻，ILK表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论:吡非尼酮抑制肾间质纤维化进展，下调ILK表达，推测吡非尼酮改善肾间质纤维化可能与下调ILK的表达有关。

关键词:吡非尼酮;肾间质纤维化;单侧输尿管梗阻; UUO，整合素连接激酶

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是慢性肾脏疾病最终的共同途径［1］，且纤维化的进展与肾功能不全的程度相一致，故寻找一种安全有效治疗肾间质纤维化的药物是预防慢性肾脏病进展的主要方法。吡非尼酮(Pirfenidone，PFD)是一种口服的具有抗炎、抗纤维化作用的吡啶酮衍生物，由于其在博来霉素诱导的仓鼠特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)模型中抗纤维化作用的发现，近年来成为抗纤维化研究的热点。根据国外文献报道［2～4］，吡非尼酮在多种肾损伤模型中均显示了抗纤维化作用，并能不同程度改善肾功能，有望成为逆转或抑制肾间质纤维化的新药，但确切机制尚不完全清楚。本实验旨在探究PFD在肾间质纤维化中的作用，以及其对ILK表达的影响。

1　材料与方法

1.1试剂、动物

吡非尼酮(纯度＞99%，用1%羟甲基纤维素钠配制成悬浮液) ;清洁级雄性Wistar大鼠72只，体质量(150±10) g，由佳木斯大学动物实验中心提供;兔抗大鼠ILK多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，免疫组化试剂盒、DAB试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1实验步骤

72只雄性Wistar大鼠适应喂养一周后随机分为3组:正常组(n = 24)、UUO模型组(n = 24)、治疗组(n = 24)。UUO模型组、治疗组大鼠在无菌条件下行左侧输尿管结扎: 10%水合氯醛0.3～0.4mL/100g腹腔内注射麻醉，常规消毒，大鼠背部左肋腰点下、脊柱左侧纵向切开，逐层进腹，暴露肾脏，分离输尿管，在其近端和远端分别结扎，中间离断。庆大霉素生理盐水冲洗腹腔后，逐层缝合。正常组不做任何处理。治疗组给予吡非尼酮500mg/ kg/d灌胃，正常组和UUO模型组以等量1%羟甲基纤维素钠灌胃，余饮食、水三组正常。各组大鼠在术后第3、7、14天分批处死。处死前收集大鼠24h尿液，处死当天留取静脉血和左肾组织。肾组织常规脱水、石蜡包埋、切片(厚约3μm)，行HE、Masson染色和免疫组化检测。

1.2.2生化指标检测

各组大鼠静脉血留取后进行尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)检测，尿液行尿蛋白定量检测。

1.2.3 HE、Masson染色

石蜡切片分别行HE、Masson染色，分别用来观察肾小管间质损伤情况和纤维化程度。HE染色切片在200倍光学显微镜下观察10个不同视野(不含肾小球)，参照文献方法［5］进行肾小管间质损伤评估。Masson染色切片按上述方法选取视野，光镜下绿染部分为阳性，提示纤维化，利用图像分析系统计算绿染面积占肾间质(不含肾小管管腔和大血管)面积的比值，评估纤维化程度。

1.2.4免疫组化步骤

石蜡切片在烤箱内烤片15min，温度设定为60℃。脱蜡至水，期间用0.3%甲醇－过氧化氢处理20min以充分灭活内源性酶。热抗原修复，5% BSA 37℃孵育20min，滴加1: 100兔抗大鼠ILK多克隆抗体，4℃冰箱过夜。次日恢复室温后滴加二抗山羊抗兔IgG，37.0℃孵育30min，DAB显色，苏木素轻复染，自来水蓝化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。光镜下观察ILK表达情况，视野内表现为棕黄色的颗粒即为阳性染色。每个切片在200倍光镜下随机观察10个不重叠视野(不含肾小球)，利用图像分析系统计算阳性染色面积占肾间质面积(不含肾小管管腔和大血管)的比值，取平均值。

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析，所有数据以均数±标准差(±s)的形式表示，组间均数比较应用单因素方差分析，P＜0.05时差异存在统计学意义。

2　结果

2.1生化分析

各组大鼠血BUN、Scr和24h尿蛋白等生化指标无明显差异。

2.2 HE染色

光镜下观察正常组各时间点肾组织结构正常; UUO模型组造模第3、7、14天，肾小管间质损伤逐渐加重，包括不同程度的肾小管扩张、塌陷、管型，肾小管上皮细胞肿胀、空泡变性、坏死、脱落，间质炎性细胞浸润，基底膜断裂等，与对应时间点正常组相比差异存在统计学意义(P＜0.05) ;治疗组肾小管间质损伤程度与UUO模型组相比明显减轻，差异存在统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1　不同时间点三组大鼠肾小管间质损伤评分(±s，n =8)

表1　不同时间点三组大鼠肾小管间质损伤评分(±s，n =8)

注:与对应时间点正常组相比△P＜0.05;与对应时间点UUO模型组相比＊P＜0.05。

组别3d　7d　14d正常组＜0.05　　＜0.05　　＜0.05 0.12±0.03　 0.12±0.03　 0.12±0.04 UUO模型组　1.27±0.36△　2.67±0.86△　4.47±1.21△治疗组　0.65±0.13△＊2.10±0.53△＊　3.05±0.98△＊F值　66.38　52.51　60.50 P

2.3 Masson染色

光镜下观察可见正常组三个时间点肾组织结构正常，间质基本无绿染; UUO模型组造模后第3、7、14天，染成绿色的胶原纤维逐渐增多，14d时间质基本弥漫性绿染，与正常组对应时间点相比，差异有统计学差异(P＜0.05) ;治疗组肾间质绿染的胶原纤维与UUO模型组相比明显减少，差异存在统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　不同时间点三组大鼠肾间质纤维化面积比(n =8，%)

2.4 ILK在肾小管上皮细胞的表达情况

正常组肾小管上皮细胞可见极少量ILK阳性表达;与正常组对应时间点相比，UUO模型组肾小管上皮细胞ILK表达增加，且随时间进展表达逐渐增多，差异有统计学意义(P＜0.05) ;与UUO模型组对应时间点相比，治疗组肾小管上皮细胞ILK的表达明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3　不同时间点三组大鼠肾组织ILK表达差异比较(n =8，%)

3　讨论

吡非尼酮(PFD)，5－甲基－1－苯基－2(1H)－吡啶酮［6］，是我国唯一获批的用于治疗IPF的1.1类新药。研究证实PFD是一种细胞因子阻滞剂，通过调节或阻滞多种促纤维化因子，如转化生长因β(TGF－β)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板源生长因子(PDGF)等，抑制成纤维细胞的活化、细胞增殖和细胞外基质的合成;此外还具有抗炎、清除活性氧、抑制脂质过氧化等作用，是广谱的抗纤维化小分子化合物。多项研究证实，除了IPF，PFD在5/6肾切除肾功能衰竭［2］、抗肾小球基底膜(GBM)肾炎［3］、高血压肾损伤［4］、等动物模型中，也显示出良好的抗肾纤维化和改善肾功能作用。例如，Koji Takakura实验证明吡非尼酮可以降低抗GMB肾炎大鼠尿蛋白的生成; Ji X［4］等研究发现，PFD处理6周可以通过下调高血压肾损伤大鼠TGF－β/ Smad2/3信号，降低高血压肾损伤大鼠的血压和蛋白尿的生成，并且改善肾间质纤维化。综上所述，PFD具有肾间质纤维化防治研究的良好前景。本试验建立单侧输尿管梗阻(UUO)肾间质纤维化模型，探究PFD在肾间质纤维化中的抗纤维化作用。肾间质纤维化机制众多，其中肾小管上皮细胞转分化(Epithelial－Mesenchymal Transition，EMT)起着关键性作用。而参与EMT促进肾间质纤维化的通路中，TGF－β/Smads信号通路至关重要。整合素连接激酶(Integrin－linked kinase，ILK)是1996年Hannigan发现的［7］，是一种独特的细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶和衔接蛋白，调节细胞的黏附、生长、侵袭和迁移。研究显示［8］ILK是TGF－β/Smads信号通路的下游因子，TGF－β依赖细胞内的Smads信号以时间和剂量依赖方式诱导ILK在肾小管上皮细胞表达，共同介导EMT，促进肾间质纤维化。Ji X等已经发现吡非尼酮可以下调TGF－β/Smads信号，改善肾间质纤维化，故我们推测ILK作为TGF－β/Smads下游因子，可能被PFD抑制，达到抗纤维化作用。本试验以PFD可以抑制TGF－β/Smads信号为前提，探究PFD在UUO大鼠中的抗纤维化作用及对TGF －β/Smads信号通路下游ILK表达影响。实验通过评估大鼠肾小管间质损伤、纤维化情况，检测ILK的表达，发现: UUO模型组较正常组肾小管间质损伤和纤维化加重，ILK蛋白表达增多;与UUO模型组相比，治疗组肾小管损伤和纤维化减轻，ILK表达减少，提示PFD改善肾间质纤维化，抑制了ILK的表达。

综上所述，PFD改善了UUO大鼠肾间质纤维化程度，可能与抑制TGF－β/Smads信号通路下游的ILK表达有关。PFD作为广谱抗纤维化药物，不仅不良反应少，耐受性好，而且可以改善肾功能，是肾间质纤维化防治的新希望新方向。

参考文献:

［1］刘艳姝，刘文思，刘中柱，等.活性维生素D3抑制UUO模型大鼠肾间质纤维化作用的研究及其对TGF－β1，α－SMA表达的影响［J］.黑龙江医药科学，2013，36(2) : 72－73

［2］Takakuta Koji，Fujimori Akira，Chikanishi Toshihiro，et al.Renoprotective properties of pirfenidone in subtotally nephrectomized rats ［J］.European Journal of Pharmacology，2010，629(1－3) : 118－124

［3］Koji Takakura，Kazuhiko Mizukami，Hikaru Mitori.Antiproteinuric effect of pirfenidone in a rat model of anti－glomerular basement membrane glomerulonephritis［J］.European Journal of Pharmacology，2014，737: 106－116

［4］Ji X，Naito Y，Weng H，et al.Renoprotective mechanisms of pirfenidone in hypertension－induced renal injury: through anti－fibrotic and anti－oxidative stress pathways［J］.Biomed Res，2013，34(6) : 309－319

［5］赵德安，刘君，黄倩，等.硫化氢在单侧输尿管梗阻大鼠肾小管间质纤维化中的水平变化及其干预影响［J］.中国当代儿科杂志，2013，15(10) : 903－908

［6］胡艳秋，于莲，胡俊华，等.肺靶向吡非尼酮脂质体的制备及体外释药性质研究［J］.黑龙江医药科学，2012，35(3) : 28－30

［7］赵建辉，何红权，陈洪宇，等.整合素连接激酶与肾间质纤维化［J］.中国中西医结合肾病杂志，2011，12(1) : 88－91

［8］郑杰，杨亦彬，曾强林，等.TGF－β/Smads/ILK通路与慢性环孢素肾病［J］.遵义医学院学报，2013，36(4) : 385－387

(收稿日期:2015－12－20)

通讯作者:康晓明(1961～)女，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E－mail: kanglaoshi@163.com。

作者简介:刘喜凤(1990～)女，河南焦作人，在读硕士研究生。

基金项目:①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号: LM2015_014。

中图分类号:R961

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0027－03