化痰法为指导的白芥子相关药组对肝纤维化大鼠VEGF、bFGF表达的影响*

郑保平，韩立民，林唐唐，韩　露，唐　杨，刘　真，孙小勇，吴　斌，刘海华，刘金明

(1．赣南医学院a．第一附属医院，江西　赣州　341000; 2．江西中医药大学人文学院，江西　南昌　330004)



化痰法为指导的白芥子相关药组对肝纤维化大鼠VEGF、bFGF表达的影响*

郑保平1a，韩立民1，林唐唐1a，韩露2，唐杨1a，刘真1a，孙小勇1a，吴斌1a，刘海华1a，刘金明1a

(1．赣南医学院a．第一附属医院，江西赣州341000; 2．江西中医药大学人文学院，江西南昌330004)

摘要:目的:对白芥子及其药组对实验性肝纤维化大鼠VEGF、bFGF、CoⅣ、LN的影响进行研究。方法:60只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组、白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组。除空白对照组外，其余各组均采用大鼠背部皮下注射50%CCl40．1 mL·100 g(－1)，2次·周(－1)，连续造模12周。阳性对照组、白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组于造模的第7周开始给药，阳性对照组给予秋水仙碱0．4 mg· kg(－1)，白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组的剂量分别为1．0 g·kg(－1)，共7周。采用放射免疫分析法检测肝组织匀浆CoⅣ、LN，免疫组织化学法检测各组大鼠肝组织VEGF、bFGF蛋白的表达。结果:模型组与正常组比较: CoⅣ、LN显著增高(P＜0．01)，VEGF、bFGF蛋白的表达显著增高(P＜0．05) ;白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组与模型组比较: CoⅣ、LN显著减低(P＜0．05)，VEGF、bFGF蛋白的表达显著减低(P＜0．05)。结论:以化痰理论为指导的白芥子及其药物组合对肝纤维化大鼠有一定的防治作用，其机制可能与影响VEGF、bFGF蛋白的表达有关。

关键词:肝纤维化;白芥子; VEGF; bFGF

近年来，抗肝纤维化治疗的研究虽然取得了一定进展，但由于对这种多因素、多环节、多阶段的复杂发病机制远未了解清楚，致使肝纤维化的治疗尚未取得显著性突破。中医学认为肝纤维化病程迁延，一者耗气伤阴，致使津液运无力，停积不化，为瘀、为痰;二者犯肝累脾久则及肾，统藏失节，化瘀、化痰。痰瘀互结，痰因瘀阻其凝更固，瘀因痰附其阻愈牢;遂成“痰夹瘀血，遂生窠囊”之顽症。因此从“痰”着眼，对化痰中药进行抗肝纤维化的研究很有必要。鉴于白芥子性味“辛温”，入肝、脾、肺、胃、心与胞络之经(《本草新编》)，“味辛能散，性温能行”，能“通经络”(《得配本草》)，治胁下及皮里膜外之痰(《本草求真》)，有搜剔宣通之功，又不耗损肺、胃、肝、心之气，入于气分而实宜，即用于血分而亦当者也”(《本草新编》)的特点［1］，我们在文献的基础上就白芥子相关药组对肝纤维化大鼠VEGF、bFGF的影响进行了研究，现报道如下。

1　材料与方法

1．1材料雄性SD大鼠60只，体重150～210 g，由赣南医学院实验动物中心提供。白芥子及丹参、黄芪(由赣南医学院第一附属医院中药房提供(比例为1∶1) ;秋水仙碱(colchicine，Col)为昆明股份制药有限公司产品;四氯化碳(CCl4)为北京北化精细化学品有限责任公司产品;层黏连蛋白(laminin，LN)、IV型胶原(collagen type IV，IV-C)放射免疫分析测定盒均为上海海军医学研究所生物技术中心产品;鼠抗bFGF单克隆抗体，兔抗VEGF多克隆抗体，兔SPkit及DAB等均购自武汉博士的有限公司。

1．2方法

1．2．1模型制备及给药60只大鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱对照组、白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组，共6组，每组10只大鼠。除空白对照组注射等量的生理盐水外，其它组均背部皮下注射50% CCl40．1 mL·100 g－1，2次·周－1，连续造模12周。造模第7周开始，空白对照组和模型组灌胃蒸馏水，秋水仙碱组以0．4 mg·kg－1，白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组均为1．0 g·kg－1(体重)，按2 mL·100 g－1，每日分2次，连续灌胃7周［2］。

1．2．2标本采集及处理末次造模48 h时后，采用颈椎脱臼处死大鼠，取肝左叶相同部位组织于10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，常规取材、脱水、包埋，按照免疫试剂盒说明操作以检测VEGF、bFGF，以PBS代替一抗作阴性对照。其余肝组织称重后用生理盐水制备5%的匀浆，2 000 r·min－1离心10 min取上清液，采用放射免疫法检测肝组织匀浆CoⅣ、LN。

1．2．3结果判定VEGF、bFGF以胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。①先按染色强度打分:无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;②再按阳性细胞百分比打分:阴性为0分，小于10% 为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，75%以上为4分。将①②两者的积分相乘，总分0 ～1分(－)，2～3分(+ )，4～5分(+ + )，6～7分(+ + + )。

1．2．4统计分析应用SPSS 13．0统计学软件进行统计学分析。计量指标的数据资料以±s表示，各组间测定指标的总体比较采用单因素方差分析;计数资料进行Ridit分析［3］，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

2．1白芥子及其药组对肝纤维化大鼠模型肝组织匀浆CoⅣ、LN含量的影响模型组与正常组比较CoⅣ、LN显著增高，有统计学意义(P＜0．01) ;阳性对照组与模型组比较CoⅣ、LN显著减低，有统计学意义(P＜0．05) ;白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组与模型组比较CoⅣ、LN显著减低，有统计学意义(P＜0．05)。结果见表1。

表1化痰法对肝纤维化模型大鼠肝组织匀浆CoⅣ、LN的影响/±s，ng·mL－1

表1化痰法对肝纤维化模型大鼠肝组织匀浆CoⅣ、LN的影响/±s，ng·mL－1

注:与正常组比较，△P＜0．01;与模型组比较，* P＜0．05。

组别　　动物数LN　CoIV正常对照组10　 58．96±14．02　 25．07±10．6模型对照组　10　 115．01±20．47△57．42±13．21阳性对照组　10　 100．28±22．35*46．72±11．92*白芥子组　10　 97．01±17．97*46．66±8．99*白芥子+丹参组　9　 93．34±16．73*43．23±7．92*白芥子+黄芪组　10　 95．76±19．33*44．72±9．63*△

2．2白芥子及其药组对肝纤维化大鼠模型肝组织VEGF、bFGF的影响模型组与正常组比较VEGF、bFGF显著增高，有统计学意义(P＜0．01) ;阳性对照组与模型组比较VEGF、bFGF无统计学意义;白芥子组、白芥子+丹参组、白芥子+黄芪组与模型组比较VEGF、bFGF显著降低，有统计学意义(P＜0．05)。结果见表2。

表2化痰法对肝纤维化模型大鼠肝组织VEGF、bFGF的影响/±s

注:与正常组比较，△P＜0．05;与模型组比较，※P＜0．05。

组别　　动物数　VEGF bFGF－　+　 + +　 + + +正常对照组－　+　 + +　 + + + 10　 9　 1　 0　 0　 10　 0　 0　 0模型对照组△　10　 0　 2　 5　 2　 0　 3　 4　 3阳性对照组　10　 0　 3　 6　 1　 0　 2　 6　 2白芥子组※　10　 1　 5　 4　 0　 1　 4　 4　 1白芥子+丹参组※　9　 1　 5　 2　 1　 1　 3　 5　 0白芥子+黄芪组※10　 1　 6　 3　 0　 1　 5　 4　 0

3　讨论

肝纤维化是慢性肝病演变为肝硬化的必经阶段，肝细胞损伤后以胶原为主的细胞外基质(ECM)合成增多，降解相对不足，沉积在肝内引起纤维化。HSC的激活是肝纤维化发生的中心环节，而细胞因子在HSC的激活、调节ECM生成方面发挥着重要作用，是近年来抗肝纤维化的研究热点。bFGF主要由肝窦内皮细胞、血管内皮和肝细胞等分泌，是成纤维细胞生长因子家族中的一员，是一个重要的有丝分裂原和血管生成因子。在肝病的早期阶段，由于肝组织发生微循环障碍而合成bFGF增加，刺激内皮细胞增生［4］。在肝病的中后期，bFGF在肝血管间隔及肝窦壁表达逐渐增强的同时，尚伴随α-SMA、FN、LN、ColV等强表达，表明bFGF另一个重要功能是促进细胞外基质(ECM)的产生［5］。因此bFGF一方面直接参与了肝纤维化的形成，同时又为其他细胞因子在肝组织局部发挥作用创造了条件［5］。本研究显示模型组大鼠bFGF显著增高，亦说明其参与了肝纤维的形成和发展，而白芥子相关药组干预后大鼠肝组织中的bFGF及CoⅣ、LN均显著下降，与模型组相比有显著差异(P﹤0．05)，说明白芥子及其相关药组可能是通过抑制bFGF的合成和分泌，一方面抑制内皮细胞增生、迁移及分化，影响新血管的生成，干扰肝窦毛细血管化的形成。另一方面，通过影响CoⅣ、LN的合成而起到抗肝纤维化作用的。

在肝纤维化发展过程中，新生血管化显著增高［6－7］。而具有血管生成抑制剂活性的药物，可抑制实验性肝纤维化的进展［8］，表明血管发生在肝纤维化的发展过程中起着重要作用。血管生成促进因子与血管生成抑制因子之间的平衡调节着血管形成。正常肝组织VEGF及其受体表达量极低，在肝纤维化发展过程中VEGF及其受体表达均显著增高。研究发现VEGF参与了肝窦毛细血管的形成［9］。本研究显示白芥子及其药组对肝纤维化大鼠模型进行干预后，肝组织中VEGF的表达明显下降，与模型组有显著差异(P﹤0．05)，说明白芥子相关药组可能通过抑制VEGF的合成和分泌，进而阻断肝窦毛细血管化的形成而起到抗肝纤维化作用的。

参考文献:

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Effects of Semen Sinapis Albae Related Medicine Groups on the Expression of VEGF and bFGF in Rats with Hepatic Fibrosis under the Guidance of Resolving Phlegm

ZHENG Bao-ping1，HAN Li-min2，LIN Tang-tang1，HAN Lu3，TANG Yang1，LIU Zhen1，SUN Xiao-yong1，WU Bin1，LIU Hai-hua1，LIU Jin-ming1
(1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University; 2．Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000; 3．College of humanities，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang，Jiangxi 330004)

Abstract:Objective: To study the effects of semen sinapis albae related medicine groups on VEGF，bFGF，CoⅣand LN in rats with hepatic fibrosis．Methods: 60 male SD rats were randomly divided into blank control group，model group，positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group．Rats of all groups except the control group were modeled by hypodermic injection of 0．1 mL·100 g(－1)50%CCl4twice per week for 12 weeks continuously．The positive control group，semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given medicine at the beginning of the seventh week; the positive control group was given colchicine 0．4 mg·kg(－1); semen sinapis albaegroup，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were given corresponding medicines 1．0 g·kg(－1)，7 weeks in all．Radioimmunoassay method was adopted to detect the level of CoⅣand LN in the liver homogenate．Immunohistochemical method was employed to detect the expression of VEGF and bFGF in liver tissues of rats in each group．Results: Compared with the normal group，the level of Cobook=18,ebook=25Ⅳand LN in the model group were significantly increased (P＜0．01)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly increased(P＜0．05)．Compared with the model group，the level of CoⅣand LN in the semen sinapis albae group，semen sinapis albae and salvia miltiorrhiza group，semen sinapis albae and astragalus membranaceus group were significantly reduced(P＜0．05)，and the expression of VEGF and bFGF were significantly reduced(P＜0．05)．Conclusion: The semen sinapis albae related medicine groups under the guidance of resolving phlegm have a certain preventive and therapeutic effect on hepatic fibrosis rats．The mechanism may be related to the expression of VEGF and bFGF．

Key words:hepatic fibrosis; semen sinapis albae; VEGF; bFGF

(收稿日期:2015－12－03) (责任编辑:敖慧斌)

*基金项目:国家自然科学基金项目(NO: 81460707) ;江西省卫生厅中医药科研基金(NO: 2012A050) ;赣南医学院重点项目(NO: ZD201203)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．004

中图分类号:R285．5

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0017－04