大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TASK-1表达及其与星形胶质细胞活化的关系

袁建清，钟善全，刘　铮，廖春英

(赣南医学院第一附属医院神经内科，江西　赣州　341000)



大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马CA1区TASK-1表达及其与星形胶质细胞活化的关系

袁建清，钟善全，刘铮，廖春英

(赣南医学院第一附属医院神经内科，江西赣州341000)

摘要:目的:观察一种新型双孔钾离子通道亚单元TASK-1在大鼠海马CA1区的表达及其在局灶脑缺血再灌注后的动态变化，探讨TASK-1表达与星形胶质细胞活化的关系。方法:建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)再灌注模型，采用免疫荧光组化和激光扫描共聚焦观察大鼠MCAO再灌注后3、7、28 d海马CA1区TASK-1和GFAP表达。结果:成年大鼠海马CA1区可见大量TASK-1和GFAP双标阳性的细胞，MCAO再灌注后3、7、28 d海马CA1 区TASK-1和GFAP表达逐步上调，与假手术组比较均有显著差异(P＜0．05)。结论:脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区TASK-1的表达上调与星形胶质细胞的活化有一定关系。

关键词:TASK-1通道;星形胶质细胞;海马CA1区;脑缺血

星形胶质细胞在脑缺血病理过程中起重要作用，在缺血后不同时程，增殖活化不同，有保护或加重神经元损伤的功能［1－2］。有研究［3－5］表明，双孔钾通道TASK-1表达背景或泄漏K电流，形成细胞膜静息电位，调节细胞的兴奋性，可能参与脑缺血后星形胶质细胞神经保护作用。脑缺血后大鼠海马TASK-1表达情况及与星形胶质细胞活化、增殖的关系国内外尚少见报道。本研究观察大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)后大鼠海马CA1区TASK-1的表达变化，探讨其与星形胶质细胞活化的关系，为探索脑缺血治疗的新的作用靶点提供实验依据。

1　材料与方法

1．1材料成年(3月龄)健康雄性Wistar大鼠24只，体质量250～300 g，由赣南医学院动物实验中心提供。兔抗TASK-1购于以色列Alomone Labs公司，小鼠抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)购于美国Neomarkers公司，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗小鼠IgG、花青素(Cy3)标记的驴抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驴血清均购于美国Jackson Immuno Research公司，恒冷切片机(德国Leica公司CM1900型)，激光扫描共聚焦显微镜(日本Olympus公司FV500型)。

1．2 MCAO制备及分组应用线栓法建立MCAO［6］模型。将实验大鼠随机分为4组，分别为假手术(sham)、MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d组，每组6只。术前12 h禁食，自由进水。用6%水合氯醛麻醉(300 mg·kg－1体质量)，术中维持动物直肠温度(36．6±0．5)℃。分离并结扎右侧颈总动脉、颈外动脉，注意避免刺激迷走神经。于颈总动脉近颈内动脉、颈外动脉分叉处剪一小口，插入一前端5 mm涂以硅胶的4-0丝线进入颈内动脉，深度为距离颈总动脉分叉处1．8～2．0 cm，1 h后拔出丝线进行再灌注。按Longa［6］等神经功能评分1～3分者入选MCAO 3 d、MCAO 7 d、MCAO 28 d组。假手术组除不插线栓外余步骤同上，并于24 h后取材。术后在约20℃的空调环境下单笼饲养，自由进水、进食。

1．3荧光免疫组化法检测大鼠缺血后海马CA1区TASK-1和GFAP的表达造模后的各组大鼠快速断头取脑，将脑组织置于－80℃冷冻保存。－20℃恒冷切片机自视交叉处开始，行10 μm厚连续冠状切片。冰冻切片置4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中(4℃)固定15 min，PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驴血清(NDS/PBS)封闭液封闭2 h，弃血清，滴加兔抗TASK-1(1∶200)、小鼠抗GFAP(1 ∶200)，对照组不加一抗，4℃孵育过夜; PBS振荡清洗3次，每次5 min，滴加羊抗小鼠FITC(1∶200)和驴抗兔Cy3(1∶200)，室温避光孵育1 h，流水冲洗40 min后，50%甘油封片。激光扫描共聚焦显微镜下观察，激发/发射波长为550/565 nm的CY3呈红色荧光，表示TASK-1蛋白;激发/发射波长为488/525 nm的FITC呈绿色荧光，表示星形胶质细胞染色;双标阳性的星形胶质细胞为黄色。通过image pro-plus软件(version 6．0)来测定各组双标阳性细胞的积分光密度(IOD)值。

1．4统计学方法采用SPSS 13．0统计软件。计量数据以±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

GFAP是星形胶质细胞特异性标志物，呈绿色荧光，TASK-1呈红色荧光，双标阳性的细胞呈黄色。在大鼠海马CA1区可见形态正常呈树根状或放射状的绿色荧光的星形胶质细胞(GFAP阳性)，MCAO再灌注后，星形胶质细胞增生肥大呈活化状态，缺血再灌注后3、7、28 d可见TASK-1和GFAP表达逐渐增强(见图1)。Sham、MCAO 3 d、MCAO 7 d和MCAO 28 d组海马CA1区双标阳性细胞的IOD值(×106)分别为: 1．14±0．21，2．14±0．24，2．72± 0．40和4．08±0．60，Sham组与其他三组比较，P均＜0．05; MCAO 28 d组与MCAO 3 d、MCAO 7 d组比较，P＜0．05。

图1　MCAO再灌注后TASK-1和GFAP在海马CA1区表达变化(×400)

3　讨论

双孔钾离子通道(K2P，KCNK)是近年来发现的一类新型钾离子通道，具有6个跨膜结构(6TMS)和2个孔道结构(2P)［4］，对经典的钾通道阻滞剂如四已基胺、4-氨基吡啶等不敏感，但能被体内外众多病理生理因子及化学、机械刺激所调控［7－8］，包括多聚不饱和脂肪酸、神经递质、溶血磷脂酸、第二信使、挥发性麻醉剂，还有细胞内外的pH值、渗透压、氧分压的改变、温度变化及机械牵张等。K2P表达具有线性I－V关系的背景K电流［4］，在细胞膜电位的复极化和膜静息电位的形成中起重要作用，并能稳定膜电位，调节细胞的兴奋性［4］。通过鼠类中枢神经系统K2P基因原位杂交研究显示，在所有的双孔钾离子通道亚型中，有7种表达于成年鼠类的中枢神经系统，包括TASK-1、TASK-3、TWIK-1、THIK-1、TRAAK、TREK-1和TREK-2［8－11］。

TASK-1是双孔钾离子通道的一种亚型，通过TASK-1基因敲除的小鼠研究表明，TASK-1在脑缺血中可能起着脑保护作用，TASK-1－/－的小鼠对脑缺血损伤的敏感性明显增加［12－13］，脑梗死的面积明显增大。脑缺血是一种致死率、致残率极高的常见病。近年来对其研究一直集中于神经元，但迄今尚无有效根治措施。现国内外许多研究表明，星形胶质细胞在脑缺血病理过程中起重要作用，在缺血后不同时程，增殖活化不同，具有保护或加重神经元损伤的不同功能［14－15］。星形胶质细胞的神经保护作用依赖于其表达特征性的具有线性I－V关系的被动电传导，且具有低的膜电位(－75 mV)及低的膜电阻［16］。有研究表明TASK-1和TREK-1功能性表达于海马区成熟的星形胶质细胞，是其特征电传导的通道基础，并认为脑缺血时所产生的损伤因子可能通过作用于星型胶质细胞K2P来影响胶质细胞的活化增殖及缓冲功能，从而影响神经元的命运［17－18］。

本研究中发现，大鼠海马CA1区星形胶质细胞表达TASK-1通道蛋白，MCAO再灌注后，其表达逐步上调且与星形胶质细胞的活化有一定关系。因此推测，脑缺血时所产生的损伤因子可能通过作用于星形胶质细胞上表达的K2P来影响胶质细胞的电生理特性、平衡缓冲功能及活化增殖，进而影响神经元的命运，从而可能成为今后缺血性脑卒中治疗的潜在靶点。

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Changes in TASK-1 Expression and Its Involvement in Astrogliosis Following Cerebral Ischemia in Rat CA1 region of Hippocampus

YUAN Jian-qing，ZHONGg Shan-quan，LIU Zheng，LIAO Chun-ying
(Dept．of Neurology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000)

Abstract:Objective: To investigate changes in TASK-1 expression and its involvement in astrogliosis following cerebral ischemia in rat CA1 region of hippocampus．Methods: Focal ischemia was induced by temporary middle cerebral artery occlusion (MCAO)．The experimental rats induced by MCAO were sacrificed on days 3，7 and 28 after reperfusion．The expressions of TASK-1 and GFAP on astrocytes in the CA1 region of Hippocampus were detected by immunofluorescence and confocal microscope．Results: TASK-1 was broadly expressed on astrocytes in the CA1 region of hippocampus．After MCAO，the expressions of bothTASK-1 and GFAP on astrocytes were significantly increased at days 3，7，28 following reperfusion．Conclusion: After MCAO，the increased TASK-1 expression on astrocytes in rat CA1 region of hippocampus is related with astrocyte activation．

Key words:TASK-1 channel; Astrocyte; CA1 region of Hippocampus; Cerebral ischemia

(收稿日期:2015－11－02 ) (责任编辑:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．006

中图分类号:R743

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0024－03