骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肺纤维化的实验研究

曾省都，张　伟，康秀华

(1．赣南医学院第一附属医院，江西　赣州　341000; 2．南昌大学第一附属医院，江西　南昌　330006)



骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠肺纤维化的实验研究

曾省都1，张伟2，康秀华2

(1．赣南医学院第一附属医院，江西赣州341000; 2．南昌大学第一附属医院，江西南昌330006)

摘要:目的:探讨骨髓间充质干细胞移植对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化模型肺泡炎和肺纤维化的影响及其可能机制。方法:体外分离、培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，传至第四代用于实验; 60只SD大鼠随机分为阴性对照组(N组)、阳性对照组(P组)、地塞米松治疗组(D组)和间充质干细胞移植治疗组(M组)，每组各15只大鼠。P组、D组和M组分别经气管注入博莱霉素制备肺纤维化模型。造模后7、14、21天留取肺组织，HE染色观察肺泡炎和肺纤维化的程度，免疫组化的方法测定肺组织转化生长因子β1(TGF-β1)的表达。结果:博莱霉素造模后，取肺组织行HE染色，病理符合肺纤维;在处理后的7、14和21天，与P组相比，D、M组大鼠出现肺炎和肺纤维化程度明显减轻，同时大鼠肺组织中表达转化生长因子β1(TGF-β1)的阳性细胞数明显减少(P＜0．05) ;而D、M组在第7、14、21天病理结果及转化生长因子表达的比较中，组间差异无显著性。结论:骨髓间充质干细胞移植对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化模型的肺泡炎和肺纤维化程度具有一定的抑制作用，作用机制可能与其降低肺组织转化生长因子(TGF-β1)的表达有关。

关键词:骨髓间充质干细胞;肺纤维化;转化生长因子(TGF-β1)

特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明、发病机制不清的致命性弥漫性肺间质疾病，其病理特征是肺泡上皮的损伤和成纤维细胞增殖，形成成纤维细胞灶(fibroblastfoci)［1］。美国IPF的患病率为42．7/10万，每年发病率为16．3/10万［2］，我国间质性肺疾病的发病率及患病率呈现出逐年上升的趋势［3］。IPF确诊后平均存活期为2～4年，5年生存率为30%～50%［4］。在对肺纤维化的治疗上，尚缺乏特效的疗法，因此迫切需要找到更切实可行并有实效的治疗特发性肺纤维化的方法。

干细胞一族具有自我复制和多向分化潜能的能力，为许多复杂疾病的治疗带来了新的曙光。有报道称异体骨髓来源的干细胞可以植入并分化为受者各种组织的组成细胞，包括骨、软骨、脂肪、上皮和内皮等［5］，在治疗多器官组织疾病中都被证明有作用。基于上述情况，本实验就骨髓间充质干细胞移植对肺纤维化的影响进行研究。

1　材料与方法

1．1材料雄性SD大鼠60只，体重(200±50) g;博莱霉素粉剂; DMEM低糖培养基，新生牛血清，胰酶，乙二胺四乙酸，琼脂糖，抗大鼠TGF-β1试剂等。

1．2方法

1．2．1 MSCs分离与培养无菌条件下取SD雄性大鼠股骨、胫骨，α-MEM培养基冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液转入离心管，离心，弃上清，细胞沉淀中加入含10%新生牛血清的α-MEM培养基，转入培养瓶，5%CO2培养箱中培养。换液除去非贴壁细胞，此后每3天换液1次，约80%融合时应用0．125%胰酶+ 0．02% EDTA消化传代。传至第四代时MSCs用于实验。

1．2．2动物模型建立和分组60只SD雌性大鼠随机分为4组，每组15只。阴性对照组(N组) :第0天用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，气管内一次性注射生理盐水5 mL·kg－1，注药后立即将大鼠直立、旋转，使生理盐水尽量均匀分布，苏醒后放回笼里继续饲养，未做任何处理。阳性对照组(P组) :第0天麻醉后气管内一次性注射博莱霉素5 mg· kg－1，制备博莱霉素致肺纤维化模型，苏醒后放回笼里继续饲养。地塞米松组(D组)，造模与P组相同，第2日起每日腹腔注射地塞米松0．5 mg·kg－1，连续7天。间充质干细胞移植组(M组) :造模与P组相同，造模后立即尾静脉注射间充质干细胞5× 105(PBS 200 μL)。

1．2．3动物标本的收集各组大鼠均于第7、14、21天，分别取5只用3%戊巴比妥注射麻醉，取右肺中叶于中性甲醛中固定，送病理科石蜡包埋，常规切片，HE染色及免疫组化测组织转化生长因子TGF-β1的表达。

1．2．4病理学检测在光镜下观察大鼠肺组织HE染色病理切片，根据Szapiel等［6］方法确定肺泡炎和肺纤维化程度，标准如下:肺泡炎分4级: (－) :评0分，无肺泡炎。(+ ) :评1分，轻度肺泡炎。(+ + ) :评2分，中度肺泡炎。(+ + + ) :评3分，重度肺泡炎。肺纤维化分4级: (－) :评0分，无纤维化。(+ ) :评1分，轻度纤维化。(+ + ) :评2分，中度纤维化。(+ + + ) :评3分，重度纤维化。

2　结果

2．1 MSC的分离与培养MSCs原代培养于接种后第2天出现贴壁细胞，以成纤维样细胞在数量上占绝对优势并逐渐形成集落。此外，在培养物中还可见少量圆形、透亮的造血干细胞、多核巨噬细胞及单核细胞，随着换液被除去而逐渐减少。原代细胞80%融合时进行传代，2～3代后MSCs变得较为同质，大小较均匀(图1a、b)。

图1　间充质干细胞

2．2肺泡炎严重度评分从表1可见，在肺泡炎严重度评分中，P组、D组及M组于造模后第7、14、21天均较N组重，以第7天最重，随后逐渐减轻，差异有显著性; D、M组分别与P组比，肺泡炎严重程度减轻，于造膜后第7天、14天差异有显著性(P＜0．05)，随着炎症的减轻，在造膜后21天，三者间差异无显著性; D、M两组比较在造膜后第7天、14天及21天差异无显著性(P＞0．05)。

表1肺泡炎严重度评分/±s

表1肺泡炎严重度评分/±s

注:与P组比较，* P﹤0．05;与D组比较，▲P＞0．05。

组别n　7 d　14 d　21 d N　 5　 0．2±0．45　 0±0　0±0 P　 5　 2．8±0．45　 2．0±0．71　 1．4±0．55 D　 5　 1．8±0．45*　1．2±0．45*1．2±0．45 M　 5　 1．6±0．55＊▲1．2±0．45＊▲1．0±0▲

2．3肺纤维化严重度评分从表2可见，在肺纤维化评分中，P组、D组及M组于造模后第7、14、21天高于N组，以第21天最重(P＜0．05) ; P组与D、M组比，于造膜后14天、21天，两者差异有显著性(P ﹤0．05) ; D、M两组间比较差异无显著性(P＞0．05)。

表2肺纤维化严重度评分/±s

表2肺纤维化严重度评分/±s

注:与P组比较，* P﹤0．05;与D组比较，▲P＞0．05。

组别n　7 d　14 d　21 d N　 5　 0±0　0±0　0±0 P　 5　 0．6±0．55　 2．2±0．45　 2．6±0．55 D　 5　 0．2±0．45　 1．2±0．45*　1．4±0．55*M　 5　 0．4±0．55　 1．2±0．45＊▲1．4±0．55＊▲

2．4大鼠肺组织中TGF-β1表达大鼠肺组织TGF-β1蛋白表达在胞浆，呈黄色或棕黄色颗粒，主要定位于肺泡巨噬细胞胞浆中。以细胞胞浆、胞膜、细胞外基质染为棕色为阳性;每张切片选取5个视野，计阳性细胞数/高倍视野(表3)。

从表3可见，肺组织中TGF-β1表达在P组、D组及M组于造模7、14、21天显著高于N组，差异有显著性，于7天时达高峰值;与P组比，D、M组于造膜后7、14、21天阳性细胞数均减少，两者差异有显著性(P﹤0．01，P﹤0．05) ; D、M两组间在7、14、21天阳性细胞比，差异无显著性(P＞0．05)。

表3各组各时间段TGF-β1表达阳性巨噬细胞数/阳性细胞数/高倍视野，±s

表3各组各时间段TGF-β1表达阳性巨噬细胞数/阳性细胞数/高倍视野，±s

注:与P组比较* P﹤0．01，△P﹤0．05; 与D组比较，▲P＞0．05。

组别n　TGF-β1阳性细胞数7 d　14 d　21 d N　 5　 1．12±0．39　 1．04±0．17　 1．16±0．17 P　 5　 16．96±1．23　 13．76±2．38　 10．20±1．75 D　 5　 12．72±1．38*　9．92±1．92△　7．24±1．58△M　 5　 11．98±2．37＊▲9．60±1．05△▲6．68±1．27△▲

结果显示，博莱霉素处理大鼠的肺组织TGF-β1表达明显、范围广;特别是在第7天肺泡腔和间质中出现大量的TGF-β1强阳性的肺泡巨噬细胞，肺组织中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞，可以单个或成群肺泡巨噬细胞出现，第14～21天时在肺泡腔和间质中TGF-β1阳性的肺泡巨噬细胞逐渐减少。提示表达TGF-β1蛋白的肺泡巨噬细胞在急性肺泡炎期明显增加，对肺纤维化的发生和发展可能起重要的作用(图2～5)。

图2　阴性对照组正常肺巨噬细胞转化生长因子表达(HE×200)

图3　阳性对照组第7、14及21天肺组织转化生长因子表达情况(HE×400)

图4　激素治疗组第7、14及21天肺组织转化生长因子表达情况(HE×400)

图5　骨髓间充质干细胞移植组第7、14及21天肺组织转化生长因子表达情况(HE×400)

3　讨论

转化生长因子-β1(Transformating Growth Factorbeta1，TGF-β1)是迄今为止发现最强的促纤维化因子。TGF-β1对上皮细胞生长有抑制活性，促进纤维母细胞、平滑肌细胞的生长［7－8］。因此通过抑制TGF-β1的表达来阻止由炎症引起的肺纤维化治疗方法在不断的研究中。

研究结果发现，在大鼠肺纤维化模型造模同时即给予骨髓间充质干细胞移植干预，与P组比，其肺组织肺泡炎及纤维化的程度显著减轻;与激素治疗组(D组)比，在病理切片上可见，干细胞移植组略比激素治疗组病灶稍轻，效果似乎更好。与阳性对照组比较，在造膜后第7、14、21天肺组织表达转化生长因子TGF-β1的阳性细胞数减少(P﹤0．05)，这表明，肺泡炎与肺纤维化减轻，可能与干细胞抑制肺巨噬细胞表达TGF-β1有关。

本研究主要探讨并比较了骨髓干细胞移植组(M)与激素治疗组(D)组对博莱霉素导致肺纤维化的治疗作用及可能机制。从结果中我们可以看出两种治疗方法中存在细微的差别:在免疫组化测定中，两者TGF-β1表达强阳性的肺巨噬细胞的数量都比阳性对照组(P)减少，提示两者在抑制肺纤维化的机制中有相同之处，也就是说都有通过抑制TGF-β1的表达，减缓肺纤维化的进展过程。这种不显著的差别提示，骨髓干细胞移植组(M)对博莱霉素诱导肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的抑制作用可能比激素治疗组(D)的效果较好，也可能是骨髓间充质干细胞移植组(M)对抑制肺纤维化的机制比地塞米松治疗组(D)更为复杂，它通过表达或抑制其它的生长因子或分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞甚至直接分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞完成的。当然，至于骨髓干细胞移植组(M)通过何种途径抑制转化生长因子的表达以及如何分化为肺泡上皮细胞的机制尚不清楚，值得进一步研究。

参考文献:

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［3］康健，朱元珏．特发性间质性肺炎临床研究的新动向［J］．中华结核和呼吸杂志，2007，30(4) : 241－242．

［4］Douglas WW，Ryu JH，Schroeder DR．Idiopathic pulmonary fibrosis: impact of oxygen and colchicines，prednisone，or no therapy on survival［J］．Am J Respir Crit Care Med，2000，161: 1172－1178．

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［7］Border NA，Ruolanti E．Transforming growth factor-β in disease: the tissue repair［J］．J Clin Invest，1992，90 (1) :1．

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Experimental Study of Mesenchymal Stem Cell Transplantation in the Treatment of Bleomycin-induced Pulmonary Fibrosis in Rats

ZENG Xing-du1，ZHANG Wei2，KANG Xiu-hua2
(1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi 341000;
2．The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006)

Abstract:Objective: To investigate the effects of mesenchymal stem cells transplatation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and to study the mechanism of its effects．Methods: Bone marrow MSC were harvested from male SD rats in vitro and spread to the fourth generation for the experiment．60 SD rats were randomly divided into 4 groups of 15: negative control group (Group N)，positive control group (Group P)，mesenchymal stem cells grafting group(group M) and dexamethasone treated group (Group D)．Group P，Group D and group M were made as pulmonary fibrosis models by intratracheal instillation of bleomycin．The rats were sacrificed at day 7，14，21 after modeling in batch．Lung tissues were restored to analyze the pathological changes．The content of transforming growth factor-β1(TGF-β1) was measured by using immunohistochemistry．Results: After induced by bleomycin solutions，the lung tissue was obtained and stained by HE，the pathological changes were in accordance with pulmonary fibrosis．On the 7th，14th and 21st day after treatment，the pulmonary inflammation and fibrosis extent of group D and M rats decreased obviously compared with group P．Meanwhile，the growth factor-β1(TGF-β1) positive cells in lung tissue of group D and M decreased more significantly than group P，and this shows significant difference between each group．But there is no significant difference between group D and M．Conclusions: mesenchymal stem cells grafting could decrease alveolitis and pulmonary fibrosis in rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis，the mechanism might be related to its decreasing expression of TGF-β1．

Key Words:mesenchymal stem cells; pulmonary fibrosis; transforming growth factor-β1

(收稿日期:2015－05－08) (责任编辑:敖慧斌)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．005

中图分类号:R457．7

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0020－05