肢体缺血后处理与缺血预处理对孕兔失血性休克肝损伤保护作用的比较研究*

曾晶晶，李嵩山，吴　明，冯永文

(深圳市第二人民医院深圳大学第一附属医院a．重症医学科; b．麻醉科，广东　深圳　518035)



肢体缺血后处理与缺血预处理对孕兔失血性休克肝损伤保护作用的比较研究*

曾晶晶a，李嵩山b，吴明a，冯永文a

(深圳市第二人民医院深圳大学第一附属医院a．重症医学科; b．麻醉科，广东深圳518035)

摘要:目的:比较肢体缺血后处理和肢体缺血预处理对孕兔失血性休克肝损伤保护作用的影响。方法:将32只孕兔随机分为4组:假手术组(S组)、缺血再灌注组(IR组)、肢体缺血后处理组(LRIP组)和肢体缺血预处理组(LIPC组)，每组实验动物均行双侧股动脉游离。S组:只对双侧股动脉游离; IR组:孕兔股动脉放血，维持平均动脉压40 mmHg 3 h后，1 h内匀速回输全部血液，使孕兔血压维持在MAP稳定在80 mmHg之上并平稳24 h; LRIP 组:孕兔股动脉放血3 h后，给予缺血后处理即夹闭双侧股动脉，进行10次缺血30 s再灌注30 s，再输血复苏至24 h。LIPC组:手术前24 h，重复3次采用压脉带捆扎兔单侧后肢5 min，直至后肢皮肤呈紫色、股动脉搏动消失、随后开放5 min，再行IR处理。24 h后观察血清中ALT、AST的变化，对肝组织MDA、SOD、NO及NOS的含量进行检测，ELISA法测定不同时点血清TNF-α、IL-10的含量，HE染色法进行肝组织病理学检查。结果: (1)与I/R组相比，LRIP组及LIPC组的肝组织SOD、NO、NOS含量则显著升高(P＜0．01)，而MDA含量明显降低(P＜0．01) ; (2)血清TNF-α含量降低、IL-10含量升高; (3)同时肝组织病理形态学损伤亦明显减轻，而LRIP组与LIPC组相比无显著性差异(P＞0．05)。结论:重复10次缺血30 s再灌注30 s的肢体后处理和手术前24 h重复3次对兔单侧后肢捆扎5 min、开放5 min缺血再灌注的肢体预处理，对肝脏功能具有保护作用，其机制可能与促进一氧化氮的生物学作用发挥保护效应、减少iNOS的表达、抑制再灌注后氧自由基的过量生成、改善肝脏内炎症反应有关。缺血后处理与缺血预处理对肝脏都有显著性的保护作用，但是彼此差异不显著。

关键词:肢体缺血后处理;肢体缺血预处理;失血性休克;肝损伤;一氧化氮合酶

在临床上，严重创伤、产后大出血常引发失血性休克，在休克早期，肝脏、肾脏和肠道等器官易发生功能性障碍，采用早期复苏的方法可有效降低其缺血性损害，而中后期的复苏则易造成器官的再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury，IRI)［1］。缺血再灌注损伤会加重组织和器官结构性损伤，无法达到其功能性恢复的目的。目前的研究结果表明，肢体缺血后处理［2］(Limb remote ischaemic postconditioning，LRIP)和肢体缺血预处理(Limb ischemic preconditioning，LIPC)对心和脑的再灌注损伤具有一定的保护作用［3－6］。在国内外文献中通过肢体缺血处理对肝脏损伤的研究很少。因此，本文以急性失血性休克孕兔为动物模型，通过比较LRIP和LIPC对孕兔失血性休克肝脏再灌注损伤的保护作用的差异，探讨其可能的机制。

1　材料和方法

1．1实验材料新西兰孕兔32只购于南方医院动物中心(实验地点使用许可证号SYXK(粤2010-0143)，动物生产许可证号: SCXK(粤2011-0069)，生理年龄1～2岁，妊娠时间20～30天，体重2．65～4．62 kg;谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)分型试剂盒(丹麦DAKO公司，货号K4376/Z9537/W5600/H3421/H6271)。兔TNF-α、IL-10的ELISA试剂盒(北京晶美科技有限公司，货号27694-53-8/37634-75-2)。

1．2方法

1．2．1动物分组与模型制备

1．2．1．1动物分组喂养孕兔3 d，使适应环境后随机分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(IR 组)、肢体缺血后处理组(LRIP组)、肢体缺血预处理组(LIPC组) 4组，每组8只。术前禁食12 h，自由饮水。

1．2．1．2建立模型建立孕兔失血性休克模型［7］。腹腔注射麻醉10%的水合氯醛3 mL·kg－1，麻醉后，双侧股动脉游离，连接动脉导管压力转换器，控制性放血制备失血性休克及实时监测血压。S组:只对双侧股动脉游离; IR组:孕兔股动脉放血，维持平均动脉压40 mmHg 3 h后，1 h内匀速回输全部血液，使孕兔血压维持在MAP稳定在80 mmHg之上并平稳24 h; LRIP组:孕兔股动脉放血3 h后，给予缺血后处理即夹闭双侧股动脉，进行10次缺血30 s再灌注30 s，再输血复苏至24 h。LIPC组:手术前24 h，重复3次采用压脉带捆扎兔单侧后肢5 min，直至后肢皮肤呈紫色、股动脉搏动消失、随后开放5 min，再行IR处理。

1．2．2生化指标检测测定血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的含量:恢复肝脏血流24 h后，经股动脉取血3 mL，常温1 600 r·min－1离心5 min，全自动生化分析仪测定血清中ALT与AST的含量。

1．2．3 ELISA法测定TNF-α、IL-10含量于复苏即刻(T1: 0 h)、复苏后(T2: 8 h)、复苏后(T3: 16 h)、复苏后(T4: 24 h)在麻醉下于股动脉采血3 mL，离心后，测定血清中TNF-α、IL-10不同时点(0 h、8 h、16 h、24 h)的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1．2．4组织SOD、MDA、NO、NOS含量的测定恢复肝脏血流24 h后，剪取孕兔左叶新鲜肝组织150 mg，将其制备成10%肝组织匀浆，4℃5 000 r ·min－1离心5 min，之后取上清液依照试剂盒具体操作测定SOD，MDA，NO，NOS。

1．2．5标本采集及处理24 h后，处死孕兔，切取新鲜左叶肝组织，用质量浓度为100 g·L－1的甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察。

1．3统计学处理用均数±标准差(MEAN±SD)表示实验所得数据，采用Graphpad prism 5软件进行t检验和χ2检验。P＜0．05为有统计学差异。

2　结果

2．1血清ALT及AST含量变化与S组比较，IR、LRIP、LIPC组血清ALT及AST含量迅速升高，均具有极显著性差异(P＜0．01) ;与IR组相比，LRIP、LIPC组各指标水平明显下降，亦具有显著性差异(P ＜0．05)，但LRIP与LIPC组相比，尚无显著性差异(P＞0．05)见表1。说明急性失血性休克能够造成孕兔肝功能受损，经过后处理和预处理，能够显著性的改善肝脏受损程度。

表1兔肝组织中各组肝功能指标的变化比较/U·L－1，mean±sd

2．2两组缺血处理干预后对孕兔TNF-α、IL-10的变化影响通过图1、2可以看出，与S组相比，IR组、LRIP组和LIPC组TNF-α、IL-10含量在0 h、8 h、16 h均有上升，差异显著(P＜0．05)，与IR组相比，LRIP组和LIPC组TNF-α含量在各时点均降低，差异有统计学意义(P＜0．05)，LRIP组和LIPC组的IL-10含量在0 h、8 h、16 h时均升高，差异有统计学意义(P＜0．05)。说明孕兔经肢体缺血后和肢体缺血预处理24 h后，肝脏内炎症反应有极为明显的减轻。经过肢体缺血后处理与肢体缺血预处理干预后，孕兔血清TNF-α、IL-10的变化影响如图1、2所示。

图1　肢体缺血后处理和缺血预处理在不同时间点对孕兔失血性休克血清TNF-α含量影响

图2　肢体缺血后处理和缺血预处理在不同时间点对孕兔失血性休克血清IL-10含量的影响

2．3肝组织SOD、MDA、NO、NOS含量变化3 h失血，经过再灌注后，与S组相比，肝组织IR、LRIP、LIPC组中SOD、NO、NOS含量明显降低，而MDA水平则明显升高，差异均具有显著性(P＜0．01) ;与IR组相比，LRIP、LIPC组的SOD、NO、NOS水平上升，而MDA含量下降，差异亦具有显著性(P＜0．01)，LRIP、LIPC组无显著性(P＞0．05)见表2、表3。

表2各组兔肝组织中SOD及MDA的含量变化/mean±sd

表3　各组兔肝组织中NO及NOS的含量变化/mean±sd

2．4肝组织病理形态学改变通过光学显微镜观察，S组的肝细胞饱满，细胞核规则，能够较为明显的观察到肝细胞的形态结构，肝小叶和肝窦以及毛细血管正常; IR组可见肝细胞皱缩，细胞核溢出，毛细血管有微栓子形成，有较多细胞破裂，肝窦也有红细胞大量淤积;与IR组相比，LRIP组和LIPC组肝小叶结构基本完整，毛细血管中无微栓子形成，肝细胞形态结构破坏程度低，能够较为明显的观测出细胞的形态结构; LRIP组和LIPC组的HE染色细胞形态结构较为接近(见图3)。

图3　不同组孕兔肝组织病理形态学变化

3　讨论

肢体缺血后处理是指在缺血再灌注早期，通过反复、短暂的缺血及恢复血流可达到保护组织的效果［8－11］。这种处理方式能增加其对随后缺血的耐受性［12－13］，在多种动物和脏器中被证实了这一机体的内源性保护作用［14－16］。近年来，大量实验已经证明肢体缺血后处理及肢体缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用。通过HE的病理学染色，与S组进行组织学的比较，文中图3结果显示，孕兔休克性失血模型的建立能够造成肝脏功能尤其是肝细胞的损害。

3．1肢体缺血后处理与肢体缺血预处理能减少肝细胞破坏，改善肝功能血清中ALT变化直接反映肝细胞的破坏程度，进而反映肝脏功能的变化。本研究通过监测血清中ALT、AST的变化，研究不同处理方案对肝功能的影响。结果显示，孕兔失血性休克3 h之后，肝脏即出现低灌注损伤。IR组与sham组相比，血清中ALT含量显著增高，表明孕兔失血性休克可导致肝细胞损害。予以不同的处理后，LRIP和LIPC组处理中的ALT和AST含量明显降低，表明肢体缺血后处理和肢体缺血预处理都能够减少肝细胞的破坏程度，改善肝功能。

3．2肢体缺血后处理与肢体缺血预处理能够抑制炎症反应在孕兔急性失血性休克过程中，会导致肝脏、肾脏等多器官的缺血再灌注损伤。脏器发生缺血再灌注损伤的机制在目前已经研究的较为清楚，包括炎症因子的参与，例如炎症细胞对周围组织的浸润、活化，钙超载、氧自由基的产生等等，失血性导致的肝缺血再灌注损伤与巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等免疫细胞介导的自身免疫系统密切相关，其中巨噬细胞在其中对周围组织的浸润尤为严重。在缺血过程中，能够激活中性粒细胞，造成周围组织释放更多的炎症因子，包括白细胞介素(IL-8)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等等。

本实验结果显示，S组TNF-α及IL-10的含量在任何时间点都没有显著的改变，IR、LRIP组、LIPC组的血清TNF-α均在8 h最高、IL-10均在16 h最高，后再次下降;与S组相比，IR组在各时间点的TNF-α、IL-10含量有显著性升高(P＜0．05)，与IR组相比，LRIP组和LIPC组在各时间点的TNF-α、IL-10含量则有所下调。根据实验结果推断肢体缺血后处理与肢体缺血预处理减少肝脏损伤可能的途径是通过抑制中性粒细胞在组织器官的聚积和细胞因子(TNF-α和IL-6)的释放来减轻组织缺血再灌注损伤的程度［17］。说明LRIP和LIPC可以改善肝内炎症反应，调节巨噬细胞生存的微环境，保护肝功能。因为中性粒细胞CD11/CD18的表达能够通过TNF-α增强，所以也能够促进中性粒细胞对周围细胞和组织的渗出与粘附。

3．3肢体缺血后处理与肢体缺血预处理能够抑制氧自由基产生以及促进NO的生物学作用本文实验结果显示，与S组相比，肝组织IR、LRIP、LIPC组中SOD、NO、NOS含量明显降低，而MDA水平则明显升高;与IR组相比，LRIP、LIPC组的SOD、NO、NOS水平上升，而MDA含量下降，这说明缺血后，氧自由基大量产生，对肝脏的功能会有较强的损害，而肢体缺血后处理和肢体缺血预处理可通过对这些细胞因子和氧自由基的产生，同时加强NO的生物学功能，进而降低肝脏缺血再灌注时的损伤。活性氧(ROS)在缺血再灌注损伤时程度的减轻发挥着重要作用［18］。ROS是在缺血后产生的，与丙二醛水平的上升有密切关系。肢体缺血后处理和预处理能通过减少超氧自由基的生成来保护组织，与减少脂类氧化产物(MDA)相关。

孙凯［19－20］等人在肢体缺血后处理的研究中，发现氧自由基的大量产生能够对周围组织和细胞进行破坏，抑制氧自由基过量产生能够改善微环境，对缺血再灌注损伤能够起到减轻的作用，同时NO能够降低巨噬细胞的浸润和粘附，减少缺血对内皮细胞和周围组织造成的损伤，本实验观察到的结果与此结论相符。

综上所述，肢体后处理与预处理对孕兔失血性休克的肝脏缺血再灌注损伤同样具有保护作用，在病程中，两者治疗手段相辅相成。肢体缺血预处理能够在较早时间内预防病情的产生，同时能够减少肝功能的损害，一旦形成损伤，预处理治疗的最佳时间失去，而肢体缺血后处理能够发挥至关重要的作用，正好弥补预处理在治疗缺血再灌注损伤上的不足，具有良好的应用前景。

参考文献:

［1］Andreka G，Vertesaljai M，Szantho G，et al．Remote ischaemic postconditioning protects the heart during acute myocardial infarction in pigs［J］．Heart，2007，93(6) : 749－752．

［2］李嵩山，吴明，曾晶晶，等．肢体缺血后处理对孕兔失血性休克急性肾损伤的保护及作用机制［J］．赣南医学院学报，2014，34(3) : 335－340．

［3］Ren C，Yan Z，Wei D，et al．Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats［J］．Brain Res，2009，1288: 88－94．

［4］Davies WR，Brown AJ，Watson W，et al．Remote ischemic preconditioning improves outcome at 6 years after elective percutaneous coronary intervention: the CRISP stent trial long-term follow-up［J］．Circ Cardiovasc Interv，2013，6: 246－251．

［5］陈丽，叶军明，彭道珍，等．脑缺血预处理中大鼠海马Notch信号通路的变化［J］．赣南医学院学报，2012，32 (2) : 10－12．

［6］Tissier R，Waintraub x，CouVreur N，et al．Phannacological postconditioning with the phytoestrogen genistein［J］．J Mol Cell Cardiol，2007，(42) : 79－87．

［7］王晨虹，涂新枝，张铨富，等．早期限制性液体复苏孕兔失血性休克的疗效评价［J］．实用妇产科杂，2008，24(3) : 152－155．

［8］Mohammad BK，Kumar VA，Jennifer L．Waller，et al．Remote Ischemic Postconditioning: Harnessing Endogenous Protection in a Murine Model of Vascular Cognitive Impairment ［J］．Translational Stroke Research，2015，1:67－69．

［9］M．Flück，R．S．von Allmen，C．Ferrié，et al．Protective Effect of Focal Adhesion Kinase against Skeletal MuscleReperfusion Injury after Acute Limb Ischemia［J］．Eur J Vasc Endovasc Surg，2015，49: 306－313．

［10］Tongqiang Liu，Yi Fang，Shaopeng Liu，et al．Limb ischemic preconditioning protects against contrast-induced acute kidney injury in rats via phosphorylation of GSK-3β ［J］．Free Radical Biology and Medicine，2015，81: 170 －182．

［11］Zhao Z-Q，Corvem JS，Halkos ME，et al．Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioningduring reperfusion: comparison with ischemic preconditioning ［J］．Am J Physiol(Heart Circ Physi01)，2003，285: 579－588．

［12］Freixa X，Bellera N，Ortiz-Pérez JT，et al．Ischaemic postconditioning revisited: lack of effects on infarct size following primary percutaneous coronaryintervention ［J］．Eur Heart J，2012，33: 103－112．

［13］Deftereos S，Giannopoulos G，Tzalamouras V，et al．Renoprotective effect of remote ischemic post-conditioning by intermittent balloon inflations in patients undergoing percutaneous coronaryintervention［J］．J Am Coll Cardiol，2013，61: 1949－1955．

［14］Lang SC，Elsasser A，Scheler C，et al．Myocardial preconditioning and remote renal preconditioning identifying a protective factor using proteomic methods［J］．Basic Res Cardiol，2006，101(2) : 149－158．

［15］Akcay A，Nguyen Q，Edelstein C L．Mediators of inflammation in Acute Kidney Injury［J］．Mediators Inflamm，2009，2009: 137072．

［16］Ricardo SD，Goor HV，Eddy AA．Macrophage diversity in renal injury and repair［J］．J Clin Invest，2008，118 (11) : 3522－3530．

［17］汪涛，冷玉芳，张悦，等．肢体缺血后处理和盐酸戊乙奎醚防治胃缺血再灌注损伤的实验观察［J］．中华医学杂志，2011，91(16) : 1130－1135．

［18］Jeroudi MO，Hartley CJ，Bolli R．Myocardial reperfusion injury: role of oxygen radicals and potential ther8py with antioxidants［J］．Am J Cardiol，1994，(73) : 2B－7B．

［19］Yang X-M，Proctor JB，Cui L，et al．Brief coronary occlusions during earIy reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways［J］．J Am Coll Cardiol，2004，(44) : 1103－1110．

［20］孙凯，刘志苏，孙权．缺血后处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用［J］．武汉大学学报(医学版)，2004，25 (2) : 104－107．

A Comparative Study of Protective Effect of Limb Ischemia Postconditioning with Limb Ischemia Preconditioning on Liver Injury in Pregnant Rabbits with Hemorrhagic Shock

ZENG Jing-jing1，LI Song-shan2，WU Ming1，FENG Yong-wen1
(1．Dept．of ICU; 2．Dept．of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518035)

Abstract:objective: To compare the protective effect of the Limb ischemia post-processing with Limb ischemic preprocessing on liver injury in pregnant rabbits with hemorrhagic shock．Methods: 32 pregnant rabbits were randomly divided into 4 groups: sham operation group(S)，ischemia reperfusion group(IR)，limb remote ischemia post-processing group (LRIP) and limb ischemic preconditioning group(LIPC)．Each group of experimental animals was treated by bilateral femoral artery dissociation．S group was treated only by bilateral femoral artery dissociated．In IR group，the femoral arteries of the pregnant rabbits were bleeded．maintaining the mean arterial pressure 40 mmHg for 3 hours，then all the blood lost were transfused back at a conctant speed within one hour．The blood pressure of pregnant rabbits was maintained at MAP，being above 80 mmHg stable for 24 hours．In LRIP group，the femoral arteries of the pregnant rabbits were bleeded for 3 hours，given ischemia post-processing，which was clamping bilateral femoral artery，ischemia for 30 s and reperfusion for 30 s for 10 times，and recovered by blood transfusion for 24 hours．In LIPC group，24 hours beforebook=32,ebook=39the surgery，the unilateral hind limbs of rabbits were tied up with the pressure pulse band for 5 min for 3 times until the skin of the hind legs was purple and the femoral artery pulse was disappeared．Subsequently the band was removed for 5 minutes，then the IR processing was employed．24 hours later，the change of ALT，AST in serum were observed; the content of MDA，NO，SOD and NOS of the hepatic tissue were detected; the contents of TNF-α and IL-10 in different points in serum were detected by ELISA method．Pathological examination of liver tissue were employ by HE staining method．Results: (1) Compared with IR group，the content of MDA，NO，SOD and NOS of the hepatic tissues of LRIP group and LIPC group were increased obviously (P＜0．01)，but the MDA contents obviously decreased(P＜0．01) ; (2) In serum，TNF-α contents decreased and IL-10 contents increased; (3) At the same time，the pathological damages of liver tissue were significantly reduced，and there was no significant difference between LRIP group and LIPC group (P＞0．05)．Conclusion: To repeat 10 times 30s reperfusion for 30 s for limb post-processing and to repeat it 3 times on unilateral hind limb of rabbits 24 hours before surgery，with being tied up for 5 minutes and being undone for 5 minutes in ischemia reperfusion for Limb preprocessing，have protective effect on liver function．The mechanism may be related to promoting biological effects of nitric oxide to play a protective effect，reducing the expression of iNOS，inhibiting excessive generation of oxygen free radicals after reperfusion，improving liver inflammation．Both the Ischemia postconditioninging and the Ischemia preconditioning have a significant protective effect，but the difference was not significant．

Key words:limb ischemic postconditioning; limb ischemia preconditioning; hemorrhagic shock; Liver injury; Nitric oxide synthase

(收稿日期:2015－10－14) (责任编辑:敖慧斌)

通讯作者:冯永文，男，医学硕士，主任医师，研究方向:多器官功能障碍的研究。E-mail: jingjing064@ aliyun．com

*基金项目:深圳市科技计划项目(201102047)

DOI:10．3969/j．issn．1001－5779．2016．01．008

中图分类号:R605．971

文献标志码:A

文章编号:1001－5779(2016) 01－0031－06