质谱技术联用分析Quark干酪水溶性多肽组成

焦晶凯，刘振民，莫蓓红，郑远荣，石春权，于华宁，朱培，孙颜君

(乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海，200436)



质谱技术联用分析Quark干酪水溶性多肽组成

焦晶凯*，刘振民，莫蓓红，郑远荣，石春权，于华宁，朱培，孙颜君

(乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海，200436)

摘要通过质谱技术联用分析了自制Quark干酪中水溶性多肽的组成，测定了干酪的理化指标及其多肽和蛋白的一级结构，结果显示：干酪涂抹性良好，质谱联用检测到62种蛋白和223条多肽，蛋白主要有K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白等，优势肽段主要来自于这些蛋白，此外，大多数多肽序列与功能性活性多肽相近或相关。

关键词Quark干酪；多肽；质谱；液相色谱-质谱联用(LC-MS)

蛋白质水解是干酪制作成熟过程中一个重要的生化反应，蛋白水解酶主要来自于凝乳剂、原料奶、主要发酵剂微生物、非发酵微生物及附属发酵剂微生物[1]。在蛋白质水解的过程中会产生一系列的多肽物质，乳源活性肽在人体中可以修复细胞、促进大脑发育、增强免疫功能、增强体能、促进细胞繁殖、抗病毒感染、抗衰老、消除体内氧自由基、改善调节内分泌及改善消化系统功能等[2]。

蛋白质的一级结构决定其空间结构，而空间结构对蛋白质的功能至关重要，因此对其一级结构的验证尤为关键，液质肽图可以精确测定蛋白质经酶切后各肽段的相对分子质量，并对每个色谱峰的肽片段定位[3]。此前测定多肽及蛋白质一级结构的方法存在很多缺点，如在20世纪50年代氨基酸测序的唯一方法是Edman降解，随后出现了自动测序仪，但是这些测序方法不仅速度慢，还需要高纯度的蛋白质样品和自由的氨基端。由于基因组学、蛋白质组学研究的深入开展，大量的功能蛋白迫切需要快速准确的测定序列的技术，经过液相色谱-质谱联用(liguid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)的分析，能得到大量肽段信息，数据库检索法和从头测序法均能准确的鉴定多肽及蛋白质的一级结构[4]，但目前还鲜少应用在干酪的多肽研究中。

Quark干酪是一种软质酸凝新鲜干酪，呈乳白色，或者淡黄色，质地柔软，稍有弹性，具有良好的涂抹性，表面不得有水或乳清析出，也不得出现干燥或粒状物，不得有细菌检出，风味呈清爽、或温和的酸味，是一种受人喜欢、易于消化的低脂、高钙、高蛋白的乳制品[5]。

本文通过LC-MS分析，采用高效液相-四极杆飞行时间串联质谱对Quark干酪进行了液质肽图分析，为后续干酪中活性多肽的研究提供了依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

CHOOZITTMMA14菌种、凝乳酶Marzyme 150MG，Danisco公司；磺基水杨酸(SSA，AR)，国药集团化学试剂有限公司；乙腈，德国Merk公司产品；甲酸、碳酸氢铵，美国Sigma公司产品；胰酶，美国Promega公司产品。

奶酪槽，英国Armfiled公司；均质机，丹麦APV公司；Inlab solids pro 三合一pH计探头，瑞士METTLER 公司；离心机，美国Sorvall；TA-Hdi型质构分析仪，英国Stable Micro Systems公司；mb45水分测定仪，美国OHAUS；水相针式滤器，上海安谱科学仪器有限公司；Dionex ultimate3000 HPLC液相系统，Dionex；四极杆飞行时间串联质谱(maxis impact UHRQ-TOF)，德国Bruker公司。

1.2实验方法

1.2.1Quark干酪的制作

使用丹尼斯克菌种CHOOZITTMMA14及凝乳酶Marzyme 150MG制作Quark干酪，菌种接种量为4DCU/100L，凝乳酶使用量为500IMCU，具体操作步骤如图1所示。所得新鲜干酪置于4℃环境下储藏，备用。

图1　Quark干酪制作流程图Fig.1　Production flow chart of Quark cheese

1.2.2理化指标的测定

pH值测定采用用Inlab solids pro 三合一pH计插入干酪样品直接测定。采用mb45水分测定仪测定干酪样品水分含量。干酪中的蛋白质测定采用国标GB 5009.5凯氏定氮法。干酪中的脂肪测定采用国标GB 5009.6索氏抽提法。干酪的质构分析采用质构仪测定，测量方式为下压，测试速度3.0 mm/s；测量后探头回程速度10 mm/s；测试距离18 mm；探头类型为HKP/SR锥形探头，每组样品平行测定5次。曲线参数及其定义：

(1)硬度：最大力值以N(g)表示，表示干酪的软硬程度。

(2)涂抹性：探头下行过程中受力曲线与时间轴所形成的峰面积为A, A表示涂抹时所需的能量，A越小越易涂抹。

1.2.3水溶性多肽的提取

将干酪样品中加入3倍于其质量的去离子水，混合均匀后置于40℃振荡水浴中保持1 h，后在4 250×g、4℃条件下离心分离30 min，去掉不溶物，上清液透过0.2 μm膜过滤，过滤后样品储存在-20℃条件下，备用。

1.2.4质谱分析

取4 mL干酪的多肽溶液，向其中加入2.5倍体积的乙腈，于-20℃沉淀1h，冷冻离心取上清，离心浓缩干燥。用300 μL 50 mmol/L NH4HCO3重溶沉淀，15 000 r/min 冷冻离心10 min，取上清转移至10 kD超滤管中，12 000 r/min，4℃超滤。取滤液，平分为2份，分别加一定量的50 mmol/L NH4HCO3，定容至200 μL。其中一份用胰酶酶解，并用1 mol/L NH4HCO3调节溶液pH值至8.0，酶解过夜。次日，向酶解后的多肽溶液加入3 μL甲酸，用Sep-PAK进行脱盐，离心浓缩干燥。另一份多肽溶液直接加入3 μL甲酸，用SeP-PAK进行脱盐，离心浓缩干燥。

干燥后的2个样品加入上样缓冲液，震荡10 min重溶，离心取40 μL样品加入样品瓶上样分析。每份样品采用纳升流速HPLC液相系统Dionex ultimate3000进行分离，经Trap柱Dionex Trap column，再经C18分析柱分离，流速为400 nL/min。经高效液相色谱脱盐及分离后用Brukermaxis impact UHR Q-tof质谱进行分析。串联质谱检测采用的是数据依赖扫描(data dependent acquisition，DDA)模式。TOF MS 扫描分辨率为20,000 (FWHM)，质荷比范围设定为m/z 50～2500；峰高超过100 cps (counts/second)，且电荷为+2～+4的10个丰度最大的多肽选择被MS/MS分析，质荷比范围为m/z 350～1500，每个cycle扫描累积时间为1.3s，动态排除时间15s。

1.2.5数据分析

原始数据baf文件用Data analysis(德国Bruker公司)软件转换为 mgf文件，用protein scape软件(version3.0)进行数据检索分析，搜索引擎为Mascot(英国Matrix Science公司)。未酶解多肽混合物样品数据用none enzyme进行搜库，经酶解的多肽混合物样品数据分别选择Trypsin和none enzyme进行2次搜库。

2结果与分析

2.1Quark干酪的理化指标

根据图1所示Quark干酪制作流程，我们得到了pH值1.36、水分69.37%、蛋白质13.7%、脂肪13.1%、硬度2.309 kg及涂抹性2.487/(kg ·s)的新鲜Quark干酪，干酪涂抹性良好，这些理化指标作为后续检测Quark干酪中多肽成分的理论基础。

表1　制作Quark干酪理化指标结果

2.2LC-MS分析Quark干酪中蛋白和多肽种类

Quark干酪前处理分别使用了酶解和非酶解2种方法，更全面地分析了Quark干酪的蛋白和多肽组成成分，如图2和图3所示，分别是非酶解和酶解后的分析色谱图，LC-MS分析出共有62种蛋白达到检测限，并分析出来自于这些蛋白的多肽223条。

这些蛋白包含K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白、α-s2-酪蛋白、血清白蛋白、β2-微球蛋白、Α-1B-糖蛋白等组成蛋白；还包含酸性哺乳动物几丁质酶(AMCase)、视网膜鸟苷酸环化酶2、乳过氧(化)物酶、MOV-10解旋酶、肽基脯氨酰顺反异构酶Ç、泛素羧基末端水解酶10、脂肪酸合酶及RNA聚合酶等酶类蛋白；此外还有一些如如胆碱转运体样蛋白2等载体蛋白、如钙稳态调节蛋白2等调节蛋白、纤维鞘CABYR结合蛋白等结合蛋白及一些抗菌肽。

分离于来自62种蛋白的多肽223条，多肽所占比例为0.11%～4.31%不等，其中有21条多肽占比达到1%以上。许多多肽彼此间是相互联系的，由于不同而复杂的蛋白酶作用于同一蛋白而形成了不同长度的肽段，如RIZZELLO等人[6]在罗曼诺羊奶酪的抗菌片段中检测到了来自β-酪蛋白158～178的VMFPPQSVL多肽序列，而在此quark干酪中检测到的同样来自于β-酪蛋白的MHQPHQPLPPTVMFPPQSVL多肽可能就是此抗菌肽序列的前导片段。本实验检测到的多肽多数与已经报道的具有抗氧化、抗菌性、ACE抑制和免疫调节功能的肽段覆盖相同序列，如来自K酪蛋白的VIESPPEINTVQVTSTAV与已报道的具有抗菌功能的TVQVTSTAV多肽序列；LC-MS检测中出现的多肽序列RDMPIQAF、KAVPYPQRDMPIQAF、SLSQSKVLPVPQKAVPYPQRDMPIQAF，他们共同具有的MPIQAF序列已被鉴定为具有抗菌活性。

来自Quark干酪的多肽组成了复杂的多肽图谱，通过MS/MS对这些多肽进行了鉴定和分析，已有报道指出干酪中的多肽通常具有较高的生物活性，如抗血栓、降胆固醇、抗氧化性、降血压、抗菌性和免疫调节等[7]，这些活性多肽成分增加了干酪的营养价值，因此对干酪中多肽的研究具有深远意义。

图2　Quark干酪前处理不经酶解分析色谱图Fig.2　chromatogram map of Quark cheese protein with none enzymatic hydrolysis

图3　Quark干酪前处理经酶解后分析色谱图Fig.3　chromatogram map of Quark cheese protein with enzymatic hydrolysis

2.3Quark干酪蛋白和多肽分布组成

表2中为主要的蛋白质组成(emPAI value>1)及其信息，emPAI 值表示该蛋白在样品中的丰度，值越高，说明该蛋白在样品中的含量越高。除K-酪蛋白、β-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-乳球蛋白、糖基化依赖性细胞粘附分子1和α-s2-酪蛋白6种蛋白外，剩余56种蛋白的emPAI值均在0.01～0.45，说明此Quark干酪中主要蛋白为K-酪蛋白，剩余56种蛋白所占比例较小。检测到的蛋白质等电点从4.47(DPY30域含蛋白1)到11.05(ASPM同源基因片段)不等，检测蛋白覆盖率最高达到72.3%。

表2　Quark干酪中主要蛋白质组成及其信息

检测到的223条多肽，但其中占比在1%以上的多肽序列仅有21条，如表3所示，这21条序列分别来自于K-酪蛋白、α-s1-酪蛋白、β-酪蛋白和β-乳球蛋白。肽段的实验分子质量与理论分子质量的差值控制在一个较小的范围之内。

表3　Quark干酪中主要多肽组成及其信息

SRYPSYGLNYY 多肽序列是此Quark干酪中含量最多的肽段，来自于K-酪蛋白，此多肽与具有血管紧张素转换酶抑制剂作用的YPSYGLNYY多肽非常相近，并且由于YPSYGLNYY在C-末端具有酪氨酸残基，被认为很可能具有抗氧化活性[8]。ARHPHPHLSF来自于K-酪蛋白，已被报道具有ACEI活性[9]，该多肽在此Quark干酪中含量位居第二。FVAPFPEVFGKEKVNEL多肽分解于α-s1-酪蛋白，此前已有报道指出此序列多肽具有ACE-抑制活性[10]。除此以外，研究分析发现，Quark干酪中多数多肽与已鉴定的功能性多肽共享相同或相似的肽段序列，也就是说这些多肽多数是这些功能性多肽的前导序列或者其进一步分解产物。21种优势肽段序列中分解于K-酪蛋白的多肽有10条，来自于β-酪蛋白的多肽有6条，分解与α-s1-酪蛋白的多肽有3条，分解于β-乳球蛋白的多肽有2条。

3结论

乳蛋白是目前生物活性肽的一个重要来源，许多带有生物活性的多肽都以非活性状态覆盖在牛乳原始蛋白中，在肠道消化或是发酵过程中，蛋白酶将其降解并释放这些带有生物活性的多肽。干酪是乳蛋白的主要凝结产物，其中所包含的生物活性多肽也是最值得研究的，在此研究中，分析出Quark干酪中含有很多功能性蛋白及活性多肽，对人体有益，此外，由研究结果可以看出不同类型和加工方式制作出的奶酪，也可能生成同一种或相似的活性多肽，进而可以进一步分析这些活性多肽的成因和机理。

参考文献

[1]MICHAELIDOU A,ALICHANIDIS E,URLAUB H,et al.Isolation and identification of some major water-soluble peptides in feta cheese[J].J Dairy Sci,1998,81(12):3 109-3 116.

[2]毛学英,南庆贤.乳及乳制品中生物活性肽的种类及功能多样性[J].中国乳品工业,2004，32(1):41-43.

[3]李萌,裴德宁,陶磊,等.液质联用法分析重组抗肿瘤抗病毒蛋白的一级结构[J].中国生物制品学杂志,2011,24(12):1 473-1 476.

[4]范学海,朱颐申,陈兰婷,等.液质联用在多肽及蛋白质定性方面的研究进展[J].生物技术通报,2014(6):62-66.

[5]刘忠成.Quark干酪超滤生产工艺的研究[D].哈尔滨：东北农业大学,2009.

[6]RIZZELLO C G,LOSITO I,GOBBETTI M,et al.Antibacterial activities of peptides from the water-soluble extracts of italian cheese varieties[J].J Dairy Sci,2005,88(7):2 348-2 360.

[7]MEIRA S M M,DAROIT D J,HELFER V E,et al.Bioactive peptides in water-soluble extracts of ovine cheeses from Southern Brazil and Uruguay[J].Food Res Int,2012,48(1):322-329.

[8]ESPEJO-CARPIO F J,DE GOBBA C,GUADIX A,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of enzymatic hydrolysates of goat milk protein fractions[J].Int Dairy J,2013,32(2):175-183.

[10]GOBBETTI M,MINERVINI F,RIZZELLO C G.Angiotensin I-converting-enzyme-inhibitory and antimicrobial bioactive peptides[J].Int J Dairy Technol,2004,57(2-3):173-188.

Applications of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of water-soluble peptides in quark cheese

JIAO Jing-kai*, LIU Zhen-min, MO Bei-hong, ZHENG Yuan-rong,SHI Chun-quan, YU Hua-ning, ZHU Pei, SUN Yan-jun

(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy & FoodCo.,Ltd., Shanghai 200436,China)

ABSTRACTWater-soluble Peptides in Quark cheese were analyzed in this paper by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry method. Physicochemical indexes, peptides and Primary Structure of protein of Quark cheese were detected. The results showed that there were 62 kinds of protein and 223 peptide fragments in the Quark cheese with high spreadability. The dominant peptides were derived from the protein like Kappa-casein, Beta-casein, Alpha-S1-casein, and Beta-lactoglobulin and so on. Furthermore, Most of the identified peptides share sequences with milk derived peptides, which have been reported to exert biologically active abilities.

Key wordsquark cheese; peptides; mass spectrometry; liquid chromatography-mass spectrometry

收稿日期：2015-07-06，改回日期：2015-09-27

基金项目：安徽省大学生创新创业计划项目(AH2014103753122)、2013年黄山学院校级科研项目(编号：2013xkj002)、2015年度安徽省教育厅高校自然科学一般研究项目(KJHS2015B03)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603033

第一作者：硕士,工程师(本文通讯作者，E-mail:xndxjjk@126.com)。