乳酸菌发酵脱除大米粉中重金属镉的机理

傅亚平，吴卫国*，王巨涛

1(湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙， 410128)　2(长沙好韻味实业发展有限公司，湖南 长沙， 410129)



乳酸菌发酵脱除大米粉中重金属镉的机理

傅亚平1，吴卫国1*，王巨涛2

1(湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙， 410128)2(长沙好韻味实业发展有限公司，湖南 长沙， 410129)

摘要以镉含量为0.647 9 mg/kg的早籼精米为原料，在前期优化得到乳酸菌发酵脱除大米粉中镉的工艺条件的基础上，研究了乳酸菌发酵脱除大米粉中重金属镉的机理。采用复配乳酸菌的不同发酵产物比较分析它们对大米粉中镉脱除率的影响；在此基础上，利用不同体积分数的乳酸和相同pH的不同酸研究乳酸对大米粉中蛋白质含量和镉脱除率的影响，并揭示了大米粉中蛋白质含量与镉脱除率之间的关系。乳酸菌发酵脱除大米粉中的镉主要是乳酸的作用，而乳酸对大米粉中镉的脱除作用不仅与酸中H+有关，还可能与乳酸的分子结构有关(乳酸分子中具有α-羟基和羧基等功能性官能团)，乳酸能促进大米粉中蛋白质的溶出，且大米粉中蛋白质含量与镉脱除率之间呈负相关关系，当大米粉中蛋白质的含量降低时，重金属镉的脱除率增加。

关键词镉；乳酸菌；大米粉；机理；脱除率

大米中重金属镉消减方法的研究主要集中在稻米加工技术方面，如砻谷、碾米、浸泡、大米淀粉或大米蛋白的提取技术等。砻谷和碾米方法对镉的脱除效果不明显[1]；浸泡、淘洗处理均能在一定程度上降低大米中的镉含量[2-3]，但镉的脱除率都较低；后两者的脱镉效果较好，但制得的淀粉产品与原淀粉品质相差较大，且淀粉提取率较低[1]。王峰[4]发现，自然发酵能显著降低大米粉中蛋白质和灰分的含量，但没有对此机理进行探究。大米中的重金属镉主要以蛋白质结合态的形式存在，并且大多分布在蛋白质含量较高的部位[5-6]，而乳酸对大米中的蛋白质有一定的溶出作用[7]。笔者在前期试验中发现，复配乳酸菌(植物乳杆菌和戊糖片球菌以体积比2∶1混合)发酵大米粉能有效脱除其中的重金属镉，并对其发酵工艺条件进行了优化[8]。本文在此基础上，从乳酸菌发酵的主要代谢产物(乳酸和酶)入手，分别考察了这些代谢产物对镉脱除率的影响，并对影响大米粉中镉脱除率的主要成分蛋白质含量进行了研究。

1材料与方法

1.1材料

早籼米(精米，镉含量为0.647 9 mg/kg，水分质量分数13.41%)，2013年产于湖南省湘阴县。

植物乳杆菌(编号：CICC21805)和戊糖片球菌(编号：CICC22737)：由湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供。

MRS肉汤(广东环凯微生物科技有限公司)，胰蛋白酶(EC3.4.21.4, 121 u/mg, 国药集团化学试剂有限公司)，1 000 μg/mL镉标准溶液(中国计量科学研究院)，Tris-HCl缓冲液(pH7.0)，乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、草酸均为食品级，磷酸二氢铵、硝酸、高氯酸为优级纯，盐酸、氢氧化钠、氯化钠、硼酸、三氯乙酸、硫酸铜、硫酸钾、甲基红、溴甲酚绿、酚酞都为分析纯；试验用水均为去离子水。

1.2仪器

AA-7000原子吸收分光光度计，岛津公司； KDN-103F自动定氮仪，上海纤检仪器有限公司；5804R 台式高速冷冻离心机，艾本德股份有限公司；BL92-ⅡDL 超声波细胞粉碎机，无锡沃信仪器有限公司；SPX-250BS-Ⅱ生化培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司； TD5A 台式低速离心机，湖南赫西仪器设备有限公司；DK 电砂浴锅，北京市永光明医疗仪器有限公司；明澈-D 24UV 超纯水机，Milipore公司。

1.3实验方法

1.3.1乳酸菌发酵产酶、乳酸对大米粉的脱镉效果和蛋白质含量的影响

乳酸菌悬液的配制：本试验在前期研究的基础上，以植物乳杆菌和戊糖片球菌作为试验菌，首先将乳酸菌进行活化增殖培养，再接种至MRS肉汤培养基中，于37 ℃下恒温培养24～48 h，直至乳酸菌浓度达到2×109CFU/mL[9]。样品制备：

1.3.1.1大米粉

原料大米经初步清理除杂后，粉碎过60目筛，过筛后将其装袋放置于15～20 ℃阴凉干燥(相对湿度为60%左右)的环境下贮藏备用。

1.3.1.2乳酸菌发酵大米粉样品

取10 g大米粉加入到装有40 mL去离子水的三角瓶中，制成大米浆液，再将上述菌悬液分别接种到大米浆液中，植物乳杆菌菌悬液的接种量为2 %(v/v)，戊糖片球菌菌悬液的接种量为1%(v/v)，三角瓶密封后放置在37 ℃的恒温培养箱中发酵24 h，待发酵完后，用去离子水洗3次，再加3倍大米粉质量的去离子水，混匀后离心脱水(3 000 r/min，5 min)，脱水后的湿渣于45 ℃热风干燥箱中干燥至恒质量，密封后置于4 ℃冰箱中保存备用[8]。

1.3.1.3胞内酶粗提物处理大米粉样品

取等量复配乳酸菌悬液在4 ℃下离心(6 000 r/min，10 min)后去除上清液，用9 g/L 的NaCl溶液洗涤沉淀3次，再加入10 mL Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)进行超声波破碎，离心分离(6 000 r/min，10 min)，上清液为胞内酶粗提液[10]。超声波工作条件：电压220 V，频率(超声3 s，间隔3 s)，每遍工作循环30次，工作6遍。再按1.3.1.2处理等质量的大米粉。

1.3.1.4胞外酶粗提物加乳酸处理大米粉样品

取相同量乳酸菌悬液在4 ℃下离心(6 000 r/min，10 min)，用全部的上清液按1.3.1.2处理等质量的大米粉[10]。

1.3.1.5乳酸处理大米粉样品

根据发酵液中的乳酸含量(φ = 5.7%)配制相同浓度的乳酸溶液，取相同量按1.3.1.2处理等质量的大米粉[10]。

1.3.1.6乳酸加胞内酶粗提物处理大米粉样品

取相同量乳酸菌悬液在4 ℃下离心(6 000 r/min，10 min)，按1.3.1.3方法制得胞内酶粗提液，在其中添加等量的1.3.1.5中的乳酸，并按1.3.1.2方法处理等质量的大米粉[10]。

1.3.1.7对照样品

取10 g大米粉于40 mL去离子水中浸泡24 h(40 ℃)，不接种，其余处理与1.3.1.2一致。

1.3.1.8空白样品

取10 g大米粉于40 mL 3 g/L的苯甲酸钠溶液中浸泡24 h(40 ℃)，不接种，其余处理同1.3.1.2。

1.3.2乳酸体积分数对大米粉的脱镉效果和蛋白质含量的影响

配制不同体积分数(1%、5%、10%、20%、40%、80%)的乳酸溶液，分别取1.5 mL上述乳酸溶液按1.3.1.2方法处理等质量的大米粉，得到不同体积分数乳酸处理的大米粉样品。并测定各大米粉中镉的脱除率和蛋白质含量，从而确定乳酸体积分数。

1.3.3不同种类酸对大米粉的脱镉效果和蛋白质含量的影响

在确定最佳乳酸体积分数的基础上，测得该体积分数乳酸的pH，配制相同pH的乙酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、盐酸和草酸溶液，分别取1.5 mL上述7种酸溶液按1.3.1.2方法处理等质量的大米粉，得到不同酸处理的大米粉样品。观察不同种类酸对大米粉脱镉效果和蛋白质含量的影响。

1.3.4大米粉中蛋白质含量对大米粉脱镉效果的影响

分别取0.2、0.4、0.8、1.6 g胰蛋白酶加入30 mL磷酸缓冲液中(pH7.5)，溶液中加入10 g大米粉，于37 ℃静置24 h后，得到不同蛋白质含量的大米粉样品[10]。测定样品中重金属镉和蛋白质的含量，并分析蛋白质含量与镉脱除率之间的相关性。

1.3.5实验指标测定方法

1.3.5.1镉含量测定

石墨炉-原子吸收光谱法[8,11]。参照国标方法并作改进，在以2 μL(20 g/L)磷酸二氢铵溶液作为基改剂的条件下，绘制吸光值与镉浓度的标准曲线，得到一元线性回归方程为：Abs=0.155 18Conc+0.012 840，r=0.999 7，式中：Conc表示试样中镉的质量浓度，ng/mL；Abs表示试样的吸光值。

1.3.5.2蛋白质含量测定

凯氏定氮法[12]。

1.3.5.3乳酸含量测定

酸碱滴定法[13]。

所有试验处理均重复3次，每次测定均重复3次，试验数据用SPSS软件进行方差分析。

2结果与分析

2.1乳酸菌发酵产酶、乳酸对大米粉脱镉效果和蛋白质含量的影响

不同乳酸菌发酵产物对大米粉中重金属镉和蛋白质的作用效果见图1。乳酸菌在发酵过程中的主要代谢产物是酶类和乳酸，而酶类可分为胞内酶和胞外酶等[10]。由图1可知，乳酸菌的不同代谢产物均能对大米粉中的重金属镉有不同程度的脱除效果，且当镉的脱除率越高时，大米粉中蛋白质的残留量越低，这说明大米粉中镉的脱除效果与蛋白质的脱除量存在着一定的关系。一些研究报道表明，大米中的重金属镉主要以蛋白质结合态的形式存在，并且大多分布在蛋白质含量较高的部位[5-6]，这说明降低大米粉中蛋白质的含量可能有助于大米粉中重金属镉的脱除。

图1　乳酸菌发酵产物对大米粉中镉和蛋白质含量的影响Fig.1　The effect of different fermented products on the content of cadmium and protein in rice powder

由统计分析可知，乳酸、胞内酶粗提物、乳酸+胞内酶粗提物和乳酸+胞外酶粗提物处理大米粉的镉脱除率指标与对照组相比差异显著(P<0.05)，说明乳酸菌的不同发酵产物对大米粉中重金属镉的脱除均有明显效果，且乳酸菌发酵脱除大米粉中的镉除了有乳酸的作用外，还有酶的作用；乳酸处理大米粉的镉脱除率指标与乳酸+胞外酶粗提物和乳酸+胞内酶粗提物相比差异不显著(P>0.05)，说明胞外酶粗提物和胞内酶粗提物对大米粉中镉脱除的作用效果与乳酸相比不明显；胞内酶粗提物处理大米粉的镉脱除率指标与乳酸+胞内酶粗提物相比差异显著(P<0.05)，说明乳酸对大米粉中镉的脱除作用明显。通过比较乳酸+胞内酶粗提物和乳酸+胞外酶粗提物的镉脱除率指标大小，发现胞内酶粗提物对大米粉的脱镉效果稍好于胞外酶粗提物。而对照组的脱镉率为24.65 %，显著低于乳酸菌不同代谢产物的脱镉率(P<0.05)，说明大米粉在自然发酵和去离子水的浸泡作用下，镉的脱除效果较差；空白组的脱镉率仅为4.36 %，明显低于其它处理组(P<0.05)，说明去离子水对大米粉中镉的溶出作用有限，且证明了大米粉中的镉主要以结合态形式存在，少部分为游离态[5]。

乳酸菌发酵脱除大米粉中的重金属镉主要是乳酸和酶的共同作用，去离子水的浸泡作用很小，且乳酸对大米粉的脱镉效果比酶的效果明显，在酶的作用中，胞内酶粗提物的脱镉效果稍好于胞外酶粗提物，这说明乳酸菌发酵大米粉脱除其中的重金属镉主要是乳酸的作用，其次是胞内酶和胞外酶的作用。

2.2乳酸体积分数对大米粉中镉的脱除率和蛋白质含量的影响

在2.1试验结果的基础上，明确乳酸是乳酸菌发酵脱除大米粉中重金属镉的主要因素，通过比较不同体积分数的乳酸溶液对大米粉中镉的脱除效果，观察乳酸对大米粉中重金属镉的脱除作用是否与H+浓度或溶液pH有关，试验结果如图2所示。

图2　乳酸体积分数对大米粉中镉和蛋白质含量的影响Fig.2　The effect of lactic acid concentration on the content of cadmium and protein in rice powder

通过图2可以看出，随着乳酸体积分数的不断增加，大米粉中镉的脱除率呈现先增加后减少的趋势，且当乳酸的体积分数为40%时，镉脱除率有最大值，这说明乳酸体积分数对大米粉中镉脱除率的影响不是越大越好，因为当乳酸溶液的体积分数过大时，过低的pH会使大米粉中的淀粉水解、可溶性物质快速溶出，增加浸泡液的黏度，反而阻碍了镉离子的溶出，降低了镉的脱除率[14]。从以上结果可知，6种不同体积分数的乳酸处理对大米粉中重金属镉的脱除都有明显作用，当乳酸的体积分数为40%时，镉的脱除率最大，且明显高于其他水平(P<0.05)，在后续试验中固定乳酸溶液的体积分数为40%。从图2还可以看出，镉脱除率越大时，大米粉中蛋白质的残留量越低，但当乳酸的体积分数由1%增加至5%时，镉脱除率由55.47%增加至76.12%，而蛋白质的下降幅度并不大，仅由6.6%降低至6.17%，这说明乳酸对大米粉中重金属镉的脱除作用不完全是通过水解蛋白质使镉元素随蛋白质一起溶出的，还可能是乳酸分子作用于镉和蛋白质的结合位点，通过打断镉与蛋白质之间的结合键，使镉离子单独从大米粉中溶出[15]。因此，乳酸对大米粉中重金属镉的脱除作用与溶液pH有关，但不是pH越低越好，并且初步推测乳酸分子对大米粉中镉的溶出作用可能有两个方面的原因，一是乳酸分子通过水解作用使蛋白质分解，从而使镉随蛋白质分子一起从大米粉中溶出；二是在低pH环境下，乳酸分子通过打断镉与蛋白质的结合键，使镉离子单独从大米粉中溶出。然而，这一推测还需后续试验进行进一步验证和探究。

2.3不同酸对大米粉中镉的脱除率和蛋白质含量的影响

测得体积分数为40%的乳酸溶液的pH为1.44，配制相同pH的乙酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、盐酸和草酸溶液，比较不同酸对大米粉脱镉效果的影响，观察不同酸处理的大米粉蛋白质含量的变化，判断大米粉中镉的脱除是否与酸分子结构有关，结果见图3。

图3　不同酸对大米粉中镉和蛋白质含量的影响Fig.3　The effect ofdifferent acids on the content of cadmium and protein in rice powder

由图3分析可知，除草酸的脱镉率为49.95 %外，其余有机酸(乳酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸)的脱镉率均在80 %左右，且显著高于无机酸盐酸(P<0.05)，蛋白质含量随着镉脱除率的增大而降低。乳酸、醋酸、柠檬酸等对蛋白质中的二硫键均有一定的破坏作用[14]，乳酸处理的大米粉蛋白质含量最低、镉脱除率最高，显著高于其他处理组(P<0.05)，且这7种酸的pH相同，说明对大米粉中蛋白质和镉的溶出效果不全是酸中H+的作用，可能还与酸的分子结构有关[10]。乳酸是具有α-羟基结构的羧酸，有报道[5-6,10]称大米中的镉元素主要以蛋白质结合态的形式存在，初步推测乳酸中的羧基与大米蛋白多肽链上的氢形成氢键以及α-羟基中的氢与多肽链上的氧形成氢键是促进蛋白质和重金属镉溶出的原因。因此，相对于其他6种酸，乳酸对大米粉中重金属镉的脱除效果更显著，这可能与乳酸的分子结构有关，但尚需进一步验证和探究。

2.4大米粉中蛋白质含量对大米粉脱镉效果的影响

胰蛋白酶能水解大米中的蛋白质，用不同质量的胰蛋白酶处理相同质量的大米粉，得到蛋白质含量与镉脱除率之间的关系如图4所示。

图4　大米粉中蛋白质含量对镉脱除率的影响Fig.4　The effect of protein content on cadmium removal ratio in rice powder

由图4可知，随着胰蛋白酶用量的增加，大米粉中蛋白质的含量逐渐降低，而对应的大米粉中镉的脱除率逐渐增加，蛋白质含量与镉脱除率之间呈负相关，大米粉中蛋白质的降解或溶出有助于重金属镉的脱除，与2.1、2.2和2.3中的试验结果相一致。这是因为大米中的镉元素主要以蛋白质结合态的形式存在[5-6]，当大米粉中的蛋白质分子被胰蛋白酶或乳酸等物质水解时，大分子蛋白质会被降解成小分子多肽，甚至是氨基酸，不断从大米粉中溶出[9]；此时与蛋白质结合的镉离子会随着蛋白质分子的不断水解，逐渐变成游离态，随之一起从大米粉中溶出。

3讨论

初步推测乳酸对大米粉中镉的溶出作用有3个方面的原因，1是乳酸分子通过水解作用使蛋白质分解，从而使镉随蛋白质分子一起从大米粉中溶出；2是在低pH环境下，乳酸分子通过打断镉与蛋白质的结合键，使镉离子单独从大米粉中溶出；3是乳酸中的羧基与大米蛋白多肽链上的氢形成氢键以及α-羟基中的氢与多肽链上的氧形成氢键以促进蛋白质和重金属镉的溶出。

4结论

(1)复配乳酸菌发酵大米粉脱除其中的重金属镉主要是发酵过程中所产乳酸和酶的共同作用，在酶的作用中，胞内酶粗提物的脱镉效果稍好于胞外酶粗提物，但对大米粉中重金属镉的脱除贡献与乳酸相比不大，所以乳酸菌发酵脱除大米粉中的镉主要还是乳酸的作用。

(2)乳酸对大米粉中镉的脱除作用与溶液pH有关，但不是pH越低越好，适宜的酸性环境有助于镉离子(二价阳离子)的溶出，且大米粉中蛋白质和镉的溶出效果不全是酸中氢离子的作用，还可能与乳酸的分子结构有关。

(3)大米粉中蛋白质含量与镉脱除率之间呈负相关关系，大米粉中蛋白质的含量降低时，其中重金属镉的脱除率增加。因此降低大米粉中蛋白质的含量可能有助于重金属镉的脱除。

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Study on mechanism of removal of cadmium in rice powder by lactic acid bacteria fermentation

FU Ya-ping1, WU Wei-guo1*，WANG Ju-tao2

1(Food Science and Technology College of Hunan Agricultural University, Changsha 410128,China)2(Changsha Haoyunwei industrial Development Co.Ltd, Changsha 410129,China)

ABSTRACTIn the previous researches, it was found that lactic acid bacteria could effectively remove cadmium in rice powder by fermentation, and the fermentation conditions were optimized. Based on this, the mechanism of removing cadmium in polished rice (cadmium content of 0.6479 mg/kg) by lactic acid bacteria fermentation was investigated herein. The effects of lactic acid bacteria and their different fermented products on the removal rate of cadmium in rice powder were compared and analyzed. The effects of lactic acid on protein content and cadmium removal rate in rice powder were studied by comparative tests of different concentration of lactic acid and different acid with same pH. The relationship between protein content and cadmium removal rate was revealed. The results showed that function of lactic acid bacteria on removing cadmium in rice powder by fermentation was related to lactic acid and enzyme (including intracellular enzyme and extracellular enzyme). However, the effect of intracellular enzyme on the removal of cadmium in rice powder was better than that of extracellular enzyme, but it’s effect was far worse than that of lactic acid. So the function of lactic acid bacteria on removing cadmium in rice powder by fermentation was still mainly related to lactic acid. And the function of lactic acid on removing cadmium in rice powder was not only related to hydrogen ions of acid, but also might related to the molecular structure of lactic acid with alpha hydroxyl and carboxyl functional groups. Lactic acid could promote protein dissolving out from rice powder. In addition, protein content in rice powder and cadmium removal rate had a significant negative correlation. The results also indicated that the increase of cadmium removal rate in rice powder was accompanied with the reduction of protein content in rice powder. This could provide a theoretical basis for further improvement of the removal rate of cadmium in rice and the large-scale industrial production of de-cadmium rice powder for feeding.

Key wordscadmium; lactic acid bacteria; rice powder; mechanism; removal rate

收稿日期：2015-10-15，改回日期：2015-11-30

基金项目：“重金属污染耕地治理修复机理及技术模式优化集成”项目(农办财函[2015]38号)；长沙市科技重大专项(K404036-21)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603018

第一作者：硕士研究生(吴卫国教授为通讯作者，E-mail：1061051403@qq.com)。