鲜切生菜贮藏期病原真菌的分离及鉴定

徐晓霞，陈安均，赵江欣，刘兴艳，费召军，邓雯瑾，李见森

(四川农业大学 食品学院, 四川 雅安，625014)



鲜切生菜贮藏期病原真菌的分离及鉴定

徐晓霞，陈安均*，赵江欣，刘兴艳，费召军，邓雯瑾，李见森

(四川农业大学 食品学院, 四川 雅安，625014)

摘要以鲜切生菜为试材，采用传统的微生物分离手段分离纯化在4 ℃贮藏过程中引起腐烂的主要病原真菌，通过回接试验验证其致病性。通过形态学观察、分子生物学鉴定以及系统发育学分析其分类地位。结果表明：从货架期终点的鲜切生菜中共筛选出菌落形态差别比较明显的病原真菌4株，经鉴定其依次为短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)、扩展青霉(Penicillium expansum)、翅孢壳霉(Emericellopsis sp).和暗孢节菱孢(Arthrinium phaeospermum)，4种病原真菌中扩展青霉为主要致病菌。

关键词鲜切生菜;病原真菌;分离;鉴定

鲜切生菜是指以新鲜生菜为原料，经筛选、清洗、切割、杀菌、包装等加工过程，再经冷藏运输进入超市、冷柜销售或快餐食品企业的即食产品[1]。其不但符合消费者对新鲜、卫生、方便、环保及健康食品的需要，而且还可以满足食品快餐业、团体饮食业、军事后勤供给的特殊需要，拓宽生菜原料的应用范围，实现生菜的综合利用。近年来鲜切生菜的消费量持续增加，具有巨大的市场前景和经济效益[2-4]。

鲜切生菜在流通过程中极易发生品质变化，且微生物侵染是造成其在贮藏期腐败变质并限制产品流通和货架期最主要的原因[5]，其中霉菌是常见的微生物致腐菌[6]，可引起多种鲜切蔬菜腐败。鲜切生菜腐败变质不仅导致其在冷藏条件下的货架期很短，同时造成了大量的经济损失，还存在一定的食品安全隐患，因此微生物病害已成为鲜切生菜进一步发展的瓶颈[7]。蔬菜很适合霉菌、细菌和酵母菌的生长，其中细菌和霉菌较常见，酵母菌数量较少[8]。但国内外对鲜切生菜病原微生物的研究主要集中在引起食源性疾病的致病菌上[9-10]，对腐败菌的研究较少，并且主要集中在采用传统培养方法对微生物菌落计数，同时对鲜切生菜病原菌研究主要集中对腐败细菌的研究[11]，对病原真菌的研究较少，无法明确导致鲜切生菜腐烂的主导真菌。因此，对鲜切生菜致腐病原真菌进行研究能够为鲜切生菜微生物病理研究奠定基础，同时为进一步有针对性的杀菌处理提供理论基础和技术借鉴，并为鲜切生菜加工过程进行有效控制提供参考，从而有效的延长鲜切生菜的货架期。

1材料与方法

1.1材料与设备

1.1.1材料

生菜购买于雅安市雨城区农贸市场，选择新鲜、健壮、无机械伤、清洁、成熟度基本一致且无病虫害的生菜作为供试材料，迅速运回实验室后置于4 ℃冰箱中备用。

1.1.2供试培养基及试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)；用于PCR扩增的试剂和扩增引物购自天根生化科技(北京)有限公司和英潍捷基(上海)贸易有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器设备

冷冻离心机(Sorvall ST 16R)，美国Thermo Fisher Scientific公司；人工气候箱(GZ-380-GSI)，韶关市广智科技设备有限公司；PCR仪(PTC-200)，BIO-RAD公司；电泳仪(DY-A)，上海康达仪器厂；凝胶成像仪(Gel Doc XR)，BIO-RAD公司；生物安全柜(HR20-ⅡA2)，青岛海尔特种电器有限公司；生化培养箱(BPC-250 F)，上海一恒科学仪器有限公司；电热手提式压力蒸汽灭菌锅(SYQ-DSX-280B)，上海申安医疗器械厂；超纯水机(Milli-Q Gradient)，美国Millipore公司。

1.2试验方法

1.2.1鲜切生菜的处理方法

新鲜生菜去除表面叶片经流动自来水冲洗，于无菌超净工作台中用75%的酒精灭菌的锋利的不锈钢刀去除中心杆茎并切分成长宽各3 cm左右的块，切分好的生菜立即在250 IU/mL nisin+0.15%柠檬酸+0.05%双乙酸钠复合抑菌剂中浸泡2 min[12]，4℃无菌蒸馏水清洗3次，手动果蔬甩干机去掉多余的水分，取200 g为1组，分为若干组，用0.02 mm聚乙烯保鲜袋包装，置于乐扣箱中，以保持鲜切生菜贮藏环境中的相对湿度，置于4 ℃条件下贮藏，在货架期终点时取样。

1.2.2菌株的分离纯化与致病性测定

在无菌条件下准确称取样品25 g，剪碎、混匀，放入225 mL无菌生理盐水(浓度0.85%)中，充分摇匀之后用1 mL移液枪加入含有9 mL的生理盐水试管中进行10倍递增稀释，稀释成所需浓度梯度，充分摇匀。选取合适梯度的稀释液0.1 mL涂布在PDA培养基上，每个稀释度做3个平行，同时分别吸取0.1 mL空白稀释液加入无菌平皿中作空白对照。从培养基上挑取典型生长的形态不同的菌落，平板划线法反复分离、纯化，直至菌落的生长状态和形态特征表现一致时得到纯的菌落，于4 ℃保存。

刮取PDA培养基平板上真菌分离物的子实体于100 mL的灭菌蒸馏水中，置涡旋仪上振荡3 min，用4层灭菌纱布过滤，去除杂质和菌丝，得到分生孢子悬浮液，用血球计数板计数，并用无菌蒸馏水调节菌悬液浓度使其最终浓度大约为1×106个/mL分生孢子，以喷雾法进行回接试验，以不接种为对照，观察感病鲜切生菜外观发病症状、发病速度与发病程度，确定它们的致病性，从而初步选择出病原真菌。根据柯赫氏法则，从接种并发病的鲜切生菜中分离纯化微生物，将分离出的菌株与所接种菌株的菌落形态及菌丝形态进行比较，判断是否与接种菌株一致，确定鲜切生菜的病原真菌。

1.2.3鲜切生菜病原真菌的鉴定

1.2.3.1病原真菌的形态学鉴定

分离的真菌在28 ℃恒温箱中培养3～7 d后，观察并记录真菌在PDA培养基上的菌落形态，包括形状、色泽、菌丝特征等。采用直接挑取法和湿室培养法[13]，显微镜观察菌丝形态、孢子形状和分生孢子梗着生情况，记录观察结果并拍照，根据《真菌鉴定手册》[14]与《真菌分类学》[15]对其进行形态学鉴定。

1.2.3.2病原真菌分子生物学鉴定

活化从鲜切生菜中已经分离纯化得到的病原真菌，按照真菌基因组DNA提取试剂盒的说明书提取DNA后，进行 ITS序列的PCR扩增。PCR扩增用引物ITS1与ITS4。PCR扩增在PCR仪上进行。PCR 反应体系(30 μL)：上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，2×PCR Master Mix 15 μL，超纯水12 μL。PCR 扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃终延伸5 min。取5 μL PCR扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，采用凝胶成像系统拍照。PCR产物由擎科生物有限公司进行测序。将得到的基因序列在NCBI数据库进行BLAST同源性检索和比对分析，获得与其同源性较高的相似序列，使用MEGA5.1进行序列比对，比对结果Neighbor-Joining法进行聚类分析，构建系统进化树[16]。

2结果与分析

2.1病原真菌的形态学鉴定结果

鲜切生菜贮藏至感官拒绝点时，利用纯培养的方法，从PDA培养基中共筛选出菌落形态差别比较明显的疑似病原真菌7株，经回接试验，确定目标菌落，共筛选出4株病原真菌，标号分别为P1、P2、P4和P5。将纯化后的菌株接种于PDA培养基，28 ℃培养2～10 d，观察菌落及显微形态结构(见图1)。

图1　真菌菌落形态与显微形态结构Fig.1　Colony morphology and microscopic structure of fungi

P1在PDA培养基上生长旺盛，菌落质地松散，丝绒状，表面干燥，边缘不整齐，培养初期菌落为白色，培养10 d后菌变为淡褐色，培养基反面为淡黄色；菌丝无隔膜，分生孢子梗直接产生于气生菌丝上，球形，透明，呈链状。根据文献[17]鉴定为帚霉属。

菌株P2在PDA培养基上培养，菌落初期白色，继续培养至10 d时，菌落向培养基周围的均匀伸展，整体呈现灰绿色，菌落表面密生绿色粉末孢子粉，菌落边缘不整齐，白色，培养皿背面黄色；其分生孢子梗从菌丝垂直生出，分散或聚集成孢梗束，菌丝具清晰隔膜，顶端分支排列成扫帚状，不对称分枝，最后一级产生分生孢子，分生孢子串生，单个孢子球形。根据上述特征将该菌鉴定为半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科青霉属。

P4在PDA培养基上圆形，浅橙粉色，中心有放射状接种点，外表呈短绒毛状，渗透在培养基表面浅层，干扁状，均匀，以接种点为中心向周围蔓延生长，培养皿的反面为橙色。菌丝无明显隔膜，菌丝末端长出分生孢子，分生孢子不易脱落且形成分支菌丝，分生孢子长的椭球形，菌株P4的形态特征与已报道翅孢壳属较为相似[18]，初步鉴定出P4为翅孢壳属。

菌株P5在PDA培养基上生长迅速，28 ℃培养2 d即可，菌落质地松散，外观干燥，白色，呈绒毛状，培养基背面为白色，菌株气生菌丝发达，初期菌丝较细，白色，培养7 d后菌落铺满整个平板，菌丝变粗，不产色素；菌丝具有隔膜，分生孢子串生，球形。根据菌落及细胞形态初步鉴定为节菱孢属[19]。

2.2致腐真菌的分子生物学鉴定结果

所提取的4株鲜切生菜病原真菌的DNA，PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳，均得到重复性好且稳定、清晰的单一条带。图2为鲜切生菜4 ℃下病原真菌PCR产物电泳图。

图2　ITS扩增电泳图Fig.2　Amplification electrophoretogram of ITS

PCR产物由擎科生物有限公司进行测序。将得到的基因序列在NCBI数据库进行BLAST同源性检索和比对分析，获得与其同源性较高的相似序列，使用MEGA5.1进行序列比对，比对结果用Neighbor-Joining法构建系统进化树，结果见图3。

3结论与讨论

从货架期终点鲜切生菜分离到7种疑似病原真菌，通过致病性测定，发现4种真菌具有致病性，接种后再分离菌株与自然腐烂分离到的菌株形态一致。根据病原真菌形态学特征及rDNA-ITS序列分析，最终确定P1为短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)，P2为扩展青霉(Penicillium expansum)，P4为翅孢壳属(Emericellopsis sp.)，P5为暗孢节菱孢(Arthrinium phaeospermum)。

由于生菜品种、贮存条件及操作环境的不同，因此所分离的病原真菌的种类受到一定的限制，随着采样数量的增大和采样地点的增多，鲜切生菜致腐真菌的种类可能还会进一步增加。目前关于这几种菌株的报道多集中在其他果蔬上，扩展青霉菌在柑橘、鲜切卷心菜上均有报道，青霉菌具有较强的致病性，可引起多种果蔬的病害[11,20]。扩展青霉产生展青霉素[21]，展青霉素是一种对动物具有致癌、致畸、致突变的真菌毒素，而腐烂的伤口有利于展青霉素产生菌扩展青霉的侵入与生长[22]，故而鲜切生菜易受到此菌的侵害。刘波等[23]报道了短柄帚霉是蘑菇的病原菌，杨建勋等[24]研究报道了短柄帚霉具有较强的致病性。饶霖在甘蔗中分离鉴定出暗孢节菱孢菌株，同时证明其具有较强的致病性[25]。但可能由于贮存条件及操作环境的不同，在其他果蔬研究报道中没有发现本实验检测到的翅孢壳属。

鲜切生菜贮藏过程中微生物的侵染严重，但目前国内外对鲜切生菜病原微生物的研究主要集中在引起食源性疾病的致病菌上[9-10]，对腐败菌的研究主要集中在对鲜切生菜腐败细菌的研究[11]，对鲜切生菜病原真菌研究报道较少，在鲜切生菜贮藏过程中病原真菌之间的相互作用、生化活性、影响因素、致病机制以及控制方法等方面还需进行深入、全面的研究，进一步加强和完善鲜切生菜病原微生物学理论，从而更全面、科学、有效地控制鲜切生菜中病原微生物的生长，提高鲜切生菜的品质，为广大的消费者提供营养、安全的鲜切生菜产品。本文对鲜切生菜病原真菌的确定可以强化鲜切生菜的质量控制，帮助企业采取有效的加工工艺，为以后鲜切生菜的保鲜研究提供了一定的理论依据。

图3　以ITS-rDNA基因序列为分子标记的真菌菌株系统进化树Fig.3　The phylogenetic tree of fungi based on ITS-rDNA sequence

测序结果表明，P1与NCBI登录号KP269018.1菌株序列相似度达99%，系统进化树同源性比对结果表明，菌株P1与短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)同源性最近，以100%的置信度聚在一支上。此外，形态学观察表明P1菌株形态特征与短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)基本一致，因此P1确定为Scopulariopsis brevicaulis。P2菌与扩展青霉(Penicillium expansum)亲缘关系最近，自检支持率达99%，与该属其他2个种存在一定距离，与其余几个属距离则更远，确定P2与Penicillium expansum为同种真菌。P4与翅孢壳属(Emericellopsissp.)同源性最高，为98%，且与其遗传距离最近，自检支持率达98%，这与NCBI比对的结果完全符合，菌株P4确定为翅孢壳属(Emericellopsissp.)。P5与暗孢节菱孢(Arthrinium phaeospermum)以99%的自检支持率聚在一起，同时，根据形态学观察确定P5为Arthrinium phaeospermum。

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Isolation and identification of pathogenic fungi from fresh-cut lettuce during storage

XU Xiao-xia，CHEN An-jun*，ZHAO Jiang-xin， LIU Xing-yan，FEI Zhao-jun，DENG Wen-jin，LI Jian-sen

(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

ABSTRACTWith fresh-cut letter as experimental material, the main pathogenic fungal were isolated and purified at 4 ℃ during its storage through the traditional microbial isolation method, and then their corruptibility were verified by tie-back experiment. The taxonomy information of these isolated fungi was analyzed through morphologic observation, molecular biological identification and phylogenetic analysis. The results showed that four pathogenic strains were isolated by comparing the differences on colony morphology of the fresh-cut lettuce at the end of shelf life, which were identified as Scopulariopsis brevicaulis, Penicillium expansum, Emericellopsis sp. and Arthrinium phaeospermum. Penicillium expansum was the main pathogenic bacteria.

Key wordsfresh-cut lettuce； pathogenic fungi； isolation； identification

收稿日期：2015-11-09，改回日期：2015-12-01

基金项目：国家高技术研究发展计划(“863”计划)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603015

第一作者：硕士研究生(陈安均副教授为通讯作者，E-mail:59191946@qq.com)。