水涝胁迫下海滨锦葵幼苗根尖细胞内Ca2+分布与变化1)

周建　　　　　　钦佩

(河南科技学院，新乡，453003)　　　　　(南京大学)



水涝胁迫下海滨锦葵幼苗根尖细胞内Ca2+分布与变化1)

周建钦佩

(河南科技学院，新乡，453003)(南京大学)

摘要采用醋酸双氧铀染色与透射电镜技术，以海滨锦葵为试验材料，连续观测水涝胁迫下及涝后恢复期间海滨锦葵根尖细胞内Ca(2+)的分布与变化特性。结果显示：随着水涝时间延长，海滨锦葵根尖细胞间隙与细胞核、液泡中钙离子沉积密度逐步降低，质体外膜上存在Ca(2+)分布，但低于对照组，而Ca(2+)向细胞质移动，在局部区域聚集，导致细胞质钙离子增加。水涝去除20 d后，细胞壁中出现钙离子沉积，细胞间隙、质体外膜上与液泡中所分布钙离子增加，细胞质所聚集的Ca(2+)逐步分散，基本不存在Ca(2+)沉积。研究认为，水涝胁迫下，海滨锦葵根尖细胞内Ca(2+)浓度迅速上升；涝后恢复期间，Ca(2+)浓度逐渐下降，起着外界信号传递的作用。

关键词水涝胁迫；海滨锦葵；根尖细胞；Ca(2+)；离子分布

分类号Q945.78

Distribution and Variation of Ca2+in Root Apical Cells ofKosteletzkyavirginica(L.) Seedlings under Waterlogging

Zhou Jian

(Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, P. R. China); Qin Pei(Nanjing University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(3)：61-67.

WithKosteletzkyavirginica(L.), we observed its distribution and variation of Ca2+in root apical cells continuously by transmission electron microscope combined with uranyl acetate staining method in and after waterlogging stress. During waterlogging, Ca2+of root apical cells mainly distributed within intercellular spaces, nuclei and vacuoles, but the density of Ca2+reduced gradually. Additionally, there were calcium ions located on outer membranes of plastids, but its density was lower than that in control within this stress. However, Ca2+showed a trend to move into cytoplasm, and accumulated to in some areas. On the 20 th day after drainage of waterlogging, the amassed calcium ions released, and almost no Ca2+distributed in cytoplasm. However, with the release of cytoplasm Ca2+, the densities of calcium ions were increased in intercellular space, vacuoles and outer membrane of plastid, a great deal of Ca2+located with cell walls in recovery period. After 20 days of recovery, the distribution of Ca2+in waterlogged plants was similar to that in control ones. The density of Ca2+in root apical cell was increased quickly in waterlogging and subsequently decreased in restoration, and Ca2+not only affected cell function, but also acted as a means to transmit outside information inK.virginicaplants.

KeywordsWaterlogging stress; Kosteletzkya virginica (L.); Root apical cell; Ca(2+); Ion distribution

植物在生长发育过程中经常遭受一系列的环境胁迫，包括生物胁迫与非生物胁迫。在相关植物胁迫研究中，其信号转导途径一直是人们关注的焦点。生物胁迫主要包括有细菌、真菌、病毒及由此产生的病害。非生物胁迫则主要包括干旱、水涝、盐碱、高温、低温冻害等[1]。植物为了适应各种环境胁迫，最大限度地减少逆境对自身的伤害，在长期的进化过程中，形成了一系列复杂的逆境信号传递机制。

钙离子是植物重要的第二信使，保持钙的恒稳态是细胞正常生长发育的前提，由此而诱发以后一系列信号转导的下游事态[2]。来自细胞外或细胞内的各种刺激，则可引起细胞内游离钙浓度的瞬时变化，产生钙信号，而后再通过不同的信号转导途径，直接或间接地调节细胞生理和生化过程。现在有关胁迫下Ca2+信号分布特性的研究主要集中于农作物与蔬菜，如小麦[3-4]、水稻[5]、花生[6-7]、玉米[8]、甘蓝[9]、甘蔗[10]、黄瓜[11-12]和辣椒[13]等，大多数为极端温度胁迫[6-7，11，13-17]。

海滨锦葵(Kosteletzkyavirginica(L.) Presl.)为锦葵科(Malvaceae)海滨锦葵属，多年生草本，主要分布在北美洲的亚热带、温带和寒温带的含盐沼泽地带，可用于开发生物柴油、饲料、药物或美化环境。1992年，海滨锦葵作为开发沿海滩头的候选物种之一，由南京大学的钦佩[18]从美国特拉华大学引入到中国。在引种过程中，海滨锦葵曾被涝害40d左右而存活，同时受害的绝大部分植物，包括柽柳死亡。

文中以海滨锦葵为试验材料，研究在水涝胁迫下，海滨锦葵根尖细胞Ca2+具体的分布与变化规律，以及水涝胁迫去除后，Ca2+在恢复期过程中有无特异的变化特征。

1材料与方法

1.1试验材料与设计

试验用种子与栽培土壤均来自于海滨锦葵苏北引种地—金海农场。经过挑选的饱满种子在质量分数95% H2SO4中侵蚀30 min，这样可以侵蚀掉海滨锦葵种子的坚硬种皮，便于种子吸水，促进种子萌芽。侵蚀后的种子在清水中漂洗干净，然后在水中浸泡24 h。选择露白的种子播种在单个塑料杯(8 cm宽,8 cm深)中，播种基质为盐土，每杯中5粒种子。种子出苗后，选择2棵壮苗定苗，去除其他萌发苗，然后，每7 d用1/4 Hogland营养液浇灌1次，2次施肥中间补水1次。出苗2月后，对所有幼苗进行选择，则取长势比较一致的作为试验材料，移到白色的盒子(长×宽×高=36 cm×26.5 cm×12 cm)中，每盒12杯。

在本次试验中共采用6大盒、60杯海滨锦葵幼苗。其中3大盒幼苗作为试验处理材料，另外3盒则作为对照，为3次重复。在试验开始时，塑料盒灌满水，进行水涝处理，水面没过土壤表面大约5 cm。在水涝处理1、10、20、30 d及涝后恢复10、20 d(即试验开始第40、50 d)时，取出栽培钵，用剪刀剪去塑料杯。然后，将带土幼苗放到水龙头下冲刷，既可以去除泥土，洗净根系，又不伤害根系。然后，快速取主根根尖，开始切片制作。

1.2试验切片的制作与观察

采用Slocum et al.[19]方法制定切片,并稍加修改。

取材：将取出的根系洗净，用厚纱布去除根系表面的水分，取根尖区域，用双刃刀片把根段切成2 mm×3 mm大小的组织薄块。

初固定：将切好的组织块迅速投入固定液中(2%多聚甲醛、1.7%焦锑酸钾、2.5%戊二醛，用0.1 mol·L-1pH值7.6的磷酸氢二钾缓冲液配制)，在完全黑暗环境下，室温固定7 h。

洗涤：用含2%焦锑酸钾的磷酸氢二钾缓冲液(pH值7.6)洗涤3次,每次约30 min。

后固定:将洗涤过的材料转移至用含2%焦锑酸钾的缓冲液(pH值7.6)配制的1%锇酸中,冰箱内4 ℃固定过夜。

洗涤：用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液清洗样品，洗涤2次，每次约30 min。分别用30%、50%、70%与90%的丙酮脱水1次，最后用100%丙酮脱水2次，每次15 min。脱水后的样品在(V(丙酮)∶V(Epon812)=1∶1、V(丙酮)∶V(Epon812)=1∶2混合物中渗透30 min，然后在纯Epon812中包埋2 h。包埋块在烘箱中30、40 ℃各聚合1 d，最后在60 ℃环境中聚合3 d。然后，对包埋块进行修块，利用LKB-Ⅴ型超薄切片机(LKB公司,瑞典)切片,切片经0.5%的醋酸双氧铀染色,在HITACHI H-600透射电子显微镜(日立公司,日本)下观察照相。

1.3对照切片的处理

将在电镜下已确定有焦锑酸钙沉淀的定位切片漂浮在0.1 mol·L-1EGTA(pH值8.0)溶液中,60 ℃处理0.5～1 h,使EGTA与Ca2+螯合,脱去原沉淀中的Ca2+,再置于电镜下观察照相。

2结果与分析

2.1水涝初期根尖细胞中钙离子分布特征

经焦锑酸钾反应后,植物细胞中的Ca2+形成焦锑酸钙沉淀,在透射电镜下表现为电子不透明的黑色颗粒。在本试验中，对照植株根细胞的细胞膜、质体外膜、细胞间隙中存在Ca2+分布(图1)。此外，在细胞壁、液泡、细胞核中也是Ca2+重要分布区域，其中，核仁与核膜也有钙离子沉积(图1)。经过1 d的水涝处理，海滨锦葵根尖细胞内Ca2+分布规律发生了一定变化，其细胞膜、细胞间隙、液泡中依然是钙离子重要分布区域，但质体外膜中的Ca2+浓度降低，明显低于对照，有的甚至没有钙离子分布；在少数细胞质中开始存在Ca2+分布，表现出钙离子向细胞质运行的趋势；细胞壁中Ca2+变化不大，是重要分布区域；在细胞核中，钙离子密度呈现上升趋势，比较密集，但聚集的大颗粒低于对照，表现出向核外扩散的趋势(图1)。

从图2可以看出，在水涝10 d的处理中，对照植株根细胞的细胞膜、质体外膜、小液泡膜上存在Ca2+分布，而在细胞壁中钙离子沉积量很少。此外，在细胞膜染色质及细胞间隙中存在大量钙离子沉淀，但在核仁中基本不存在Ca2+。而在对照植株中，部分根尖细胞发生质壁分离现象(短箭头所指)，其细胞壁、细胞膜及质体外膜均有Ca2+分布。根尖细胞间隙依然是钙离子重要库存，且在少数细胞质中有Ca2+沉积分布，表现为钙离子向细胞质运行聚集的趋势。在细胞核与液泡中，基本上不存在Ca2+沉积，明显体现出了原有钙离子向外扩散的规律。

2.2水涝中期根尖细胞中钙离子分布特征

从图3可以看出，在水涝20 d的处理中，对照植株根细胞Ca2+主要分布在细胞膜、质体外膜，少量分布在细胞质中，而在细胞壁等其他部位不见钙离子沉积。而在对照植株中，根尖细胞发生质壁分离现象(短箭头所指)，其中Ca2+主要分布在细胞膜与细胞间隙中。根尖液泡依然是钙离子库存地，存在Ca2+分布。对于细胞壁与质体外膜而言，其钙离子浓度极其低，基本上不存在Ca2+沉积。此外，在处理植株细胞中，细胞核基本不存在钙离子分布。

A．对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=3.3 μm)；B．对照组细胞壁与液泡中Ca2+分布(Bar=0.5 μm)；C．对照植株中，根尖细胞核中Ca2+分布(Bar=1.67 μm)；D．水涝植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=3.3 μm)；E．水涝植株中，细胞壁与细胞膜的钙离子分布(Bar=0.5 μm)；F．处理植株，细胞核与质体外膜的钙离子分布(Bar=1.67 μm)；CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡；N.细胞核；NU.核仁；NM.核膜。

图1水涝1 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

A.对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.0 μm)；B.对照组细胞核中Ca2+分布(Bar=1.67 μm)；C.对照植株中，根尖细胞间隙及细胞膜中Ca2+分布(Bar=3.3 μm)；D.水涝植株根尖细胞膜与细胞壁的钙离子分布(Bar=0.5 μm)；E.水涝植株中，细胞间隙与细胞核的Ca2+分布特征(Bar=1.67 μm)；F.处理植株中，细胞核与质体外膜的钙离子分布(Bar=3.3 μm);CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡；N.细胞核；NU.核仁。

图2水涝10 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

2.3水涝后期根尖细胞中钙离子分布特征

由图4可以看出，在水涝时间达到30 d时，对照植株根细胞的细胞膜、质体外膜、细胞间隙及液泡中存在Ca2+分布，而在细胞壁等其他部位中钙离子沉积量基本不存在。在处理细胞中，部分细胞发生质壁分离(短箭头所指)。与对照组比较相似，处理根尖细胞Ca2+主要分布在细胞膜、细胞间隙。然而，在质体外膜与液泡中分布着少量钙离子，且在少数细胞质中有Ca2+沉积分布，表现为钙离子向细胞质运行聚集的趋势。在细胞壁中基本上不存在Ca2+沉积，明显体现出了原有钙离子向细胞质扩散。

A.对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.0 μm)；B.对照组根尖细胞中Ca2+分布(Bar=3.3 μm)；C.水涝植株中，液泡中Ca2+分布特征(Bar=0.59 μm)；D.处理植株中，细胞核、细胞壁的钙离子分布(Bar=0.59 μm);CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡；N.细胞核。

图3水涝20 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

A.对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2 μm)；B.对照组细胞间隙中分布的Ca2+(Bar=3.33 μm)；C.对照植株中，根尖细胞液泡中Ca2+分布(Bar=0.5 μm)；D.水涝植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.5 μm)；E.水涝植株中，细胞膜、质体外膜与液泡的Ca2+分布特征(Bar=2.5 μm)；F.处理植株中，细胞核与质体外膜的钙离子分布(Bar=1.25 μm);CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡。

图4水涝30 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

2.4恢复期间根尖细胞中钙离子分布特征

由图5可以看出，在水涝去除恢复10 d时，对照植株根细胞Ca2+主要分布在细胞膜、质体外膜、细胞间隙及少量细胞质中。此外，细胞壁上分布钙离子，但浓度相对较低，而其他部位不见钙离子沉积。在对照植株中，根尖细胞尚未完全恢复，有质壁分离现象发生(短箭头所指)，其中Ca2+主要分布在细胞膜与细胞间隙中。在根尖液泡中，少量钙离子发生沉积。在少部分细胞壁上有钙离子沉积，但量少并且移向细胞壁边缘，多数细胞壁无钙离子沉积。此外，质体外膜上Ca2+浓度极其低，基本不存在沉积现象。

A、B.对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=1.25 μm)；C.对照植株中，根尖细胞间隙中Ca2+分布(Bar=0.67 μm)；D.水涝植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.5 μm)；E.水涝植株中，根尖液泡的Ca2+分布特征(Bar=2.0 μm)；F.处理植株中，细胞核与质体外膜的钙离子分布(Bar=0.83 μm);CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡。

图5在涝后恢复10 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

由图6可以看出，当恢复时间达到20 d时，对照植株根细胞的细胞膜、质体外膜、少数细胞质及细胞间隙中存在Ca2+分布，其浓度较高；细胞壁与液泡中也含有钙离子，但其浓度比较低；其他部位中钙离子沉积量基本不存在。而在对照植株中，根尖细胞基本不存在质壁分离。与对照组比较相似，处理根尖细胞Ca2+主要分布在细胞膜、细胞间隙与质体外膜。此外，在细胞壁与液泡中分布着钙离子，但浓度相对较低。在水涝30 d及涝后恢复10 d时，细胞壁上基本不存在Ca2+沉积，而经过20 d恢复后，细胞壁上钙离子存在一定沉积量，这体现出钙离子在恢复期间由细胞质向细胞壁扩散，可能重入细胞间隙钙库。

2.5细胞内黑色钙沉淀的真实性

经EGTA处理后，原先Ca2+分布的黑色沉淀区域表现出与原来沉淀物形状相同的电子透明区(图5A)，表明定位真实地反映了Ca2+的分布(图7)。

3结论与讨论

在外界胁迫下，Ca2+在植物细胞内传递胞间信号，诱导植株做出应急反应[2]，调控植株的生长与发育[20]，但不直接作用植物的抗逆能力[16]。一般认为，液泡是高等植物细胞的主要Ca2+库，细胞外间隙也存在大量的Ca2+[21]。也有研究表明,植物细胞中Ca2+主要分布于液泡和细胞壁中，叶绿体中也有不少Ca2+[7，22]。而本试验结果显示，正常生长条件下，海滨锦葵幼苗根尖细胞的Ca2+主要分布在细胞间隙、液泡与细胞膜中,质体外膜也存在一定量的钙离子沉积。在水涝胁迫1 d，质体外膜中的Ca2+浓度降低，表现钙离子向细胞质运行的趋势；在细胞核中，钙离子表现出向核外扩散的趋势(图1)。这应该是海滨锦葵在水涝初期形成的应急反应，Ca2+通过细胞壁，聚集在细胞质，传输外界胁迫信息，引发一系列的生理、生化反应[23]；通过细胞核泵出钙离子，可能是传递信息，调动核基因表达而提高植株的耐涝性。但海滨锦葵细胞核中的Ca2+运行与田景花等[13]研究的低温胁迫中核桃的相反，可能与物种差异有一定的关系。

在不同对照中，有的细胞位置或细胞系的钙离子分布特征有所变化，如在试验初期(前10 d)，细胞核中存在Ca2+沉积，然后Ca2+浓度降低，最后消失；细胞壁大部分时间存在钙离子分布。然而在试验第20、30天则基本不存在Ca2+沉积。这种变化可能与对照处理时间过长有关，整个试验时期达50 d，可能其中某时间内生长发育特征导致钙离子分布发生变化，导致对照根尖细胞局部Ca2+分布特征的差异性。

A、C.对照植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.5 μm)；B.在对照组中，根尖细胞间隙中分布的Ca2+(Bar=2.5 μm)；D.水涝植株根尖细胞的钙离子分布(Bar=2.5 μm)；E.水涝植株中，根尖细胞间隙的Ca2+分布特征(Bar=2.0 μm)；F.处理植株中，液泡钙离子分布(Bar=1.0 μm);CM.细胞膜；CW.细胞壁；CP.细胞质；IS.细胞间隙；P.质体；PM.质体外膜；V.液泡。

图6在涝后恢复20 d条件下，对照组与处理组间根尖细胞中Ca2+分布特征比较

A-C.细胞质膜经EGTA处理过的对照切片，透明区域则为原有钙离子沉积位置(短箭头所指，Bar=1.25、1、0.83 μm)；CM.细胞膜；CP.细胞质。

图7根尖细胞中Ca2+沉积的真实性检测

本试验结果显示,海滨锦葵幼苗在水涝胁迫下,其根尖细胞内Ca2+的分布变化具有一定规律性。从焦磷酸钙的沉积效果来看，随着水涝胁迫时间延长，水涝根尖细胞间隙与液泡中钙离子沉积密度逐步降低，质体外膜上所积累的Ca2+一般低于对照组，细胞核中所积累的钙离子逐步减少，直至无Ca2+沉积分布，而部分细胞质发生钙离子聚集，导致细胞质中Ca2+浓度上升，高于相应对照组。水涝胁迫去除后，经过20 d的恢复，细胞壁中逐步出现钙离子沉积，细胞间隙Ca2+浓度上升。同时，根尖细胞的质体外膜上与液泡中所分布钙离子增加，细胞质所聚集的Ca2+逐步分散，基本不存在Ca2+沉积，与相应对照组的钙离子分布规律较相近，表明水涝植株生理功能逐步恢复。

Bush[24]曾指出,细胞质中的Ca2+浓度和分布在适当范围内变化时,会在植物对外界环境的适应调节反应中起积极的作用,但是当其变化超出一定范围时,就会破坏和扰乱细胞正常的结构与功能。在本试验中，水涝植株经过30 d水涝，根尖细胞仅部分区域发生质壁分离现象，而细胞壁、质体、细胞膜外表结构正常，没有发生机构损伤或降解，表明细胞中Ca2+没有超出其临界值，同时也显示海滨锦葵幼苗的水涝极限应该超过30 d。在水涝胁迫下，根尖细胞内Ca2+水平增加可能存在多种调控因素,如质膜Ca2+通道、Ca2+泵以及Ca-K交换体系等。研究表明,在逆境胁迫下，细胞外Ca2+通过质膜上的Ca2+通道和Ca2+泵迅速进入细胞[25],使细胞内Ca2+浓度快速提高,从而直接影响到细胞的生理代谢。

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收稿日期：2015年10月14日。

第一作者简介：周建，男，1977年8月生，河南科技学院园艺园林学院，副教授。E-mail:zj200102@163.com。

1)河南省教育厅自然科学项目(14B210028)、河南科技学院2014年校攀登计划(207010714005)。

责任编辑：任俐。