植物液泡膜H+-ATPase和H+-PPase 研究进展

梁桂红, 华营鹏, 周婷, 宋海星, 张振华

(湖南农业大学资源环境学院, 长沙 410128)

高等植物的进化成功，很大程度上是由于它们独特的细胞结构。液泡作为成熟植物细胞中最大的细胞器，约占细胞体积的 90%，在细胞生长发育和植物适应逆境胁迫的过程中扮演着重要角色[1-2]。作为植物细胞中一个独特的区室结构，液泡周围被膜包被，主要参与细胞代谢产物的累积、细胞内离子稳态的调节、有毒物质向液泡内的区隔以及对细胞生理行为和信号转导系统的调控[3-4]，液泡膜上的质子泵是参与实现其生理功能的关键因素。

植物液泡膜上有两种功能和物理特性完全不同的质子泵，即液泡膜 ATP 酶(vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)和液泡膜焦磷酸酶(vacuolar H+-pyrophosphatase, V-PPase)[5-6]，这两种酶分别以 Mg·ATP 和 Mg·PPi 为底物，水解得到的 H+由胞质进入液泡中，形成细胞质与液泡间的质子电化学势梯度，驱动各种溶质分子的跨液泡膜主动运输[7-8]，维持细胞内的离子稳态和渗透平衡，减少对细胞的伤害。同时，大量 H+被泵入液泡中造成液泡酸化和细胞质碱化，为细胞中各种生理生化反应提供适宜的条件，对细胞的生长发育起着重要作用。此外，液泡作为植物细胞离子养分的储存库，在逆境胁迫条件下，定位于液泡膜上的两种质子泵 H+-ATPase 和 H+-PPase 能通过改变其结构和活性来提高植物对非生物逆境胁迫的适应能力，减少逆境胁迫对植物生长发育造成的不利影响。刘建新等[9]和 Maeshima[10]研究表明，在盐胁迫条件下 V-ATPase 和 V-PPase 的活性均显著增加，催化底物产生的 H+梯度能够通过质子反向运输机制将细胞质中过量的 Na+向液泡内运输和积累，减少有害离子对细胞的毒害作用，保护植株在盐胁迫等逆境条件下正常生长[11-13]。由此可见，液泡膜质子泵功能的正常发挥对植物体内各种生理活动的正常进行至关重要。

本文主要介绍了植物液泡膜上两种质子泵的结构特征及其在植物生长发育过程中的生理功能，并对其在植物抵御非生物逆境胁迫过程中发挥的重要作用进行阐述，为加速优质抗逆作物的育种提供方向。

1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的结构特征与生理功能

1.1 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的结构

液泡膜作为区隔植物胞质与液泡之间物质交换的屏障，其上的两个质子泵发挥着重要作用。液泡膜 H+-ATPase 是一个多亚基、高度保守的蛋白质复合体，分子质量为 400～650 kDa，在不同植物材料中约占液泡膜蛋白的 6%～8%，最高可达 30%[14]。V-ATPase 广泛存在于植物细胞中，迄今已发现的亚基有 12 种，其中大部分亚基与酵母液泡膜 H+-ATPase 有较高的同源性[6]。液泡膜 H+-ATPase 全酶结构分为亲水区 V1 和疏水区 V0 两部分：其中 V1 部分由 VHA-A、VHA-B、VHA-C、VHA-D、VHA-E、VHA-F、VHA-G 和 VHA-H 亚基组成，露于胞质一侧，主要负责 ATP 的水解；V0 部分由 VHA-a、VHA-c、VHA-d 和 VHA-e 等亚基组成，整合于膜中，起质子通道的作用，同时作为 V1 亚基聚合和装配的基点(图1A)[14-16]。与液泡膜 H+-ATPase 相比，H+-PPase 的结构简单，由一条寡肽链组成，约占膜蛋白的 1%～10%[17]，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物以及细菌中[10]。在拟南芥中，有 3 种编码 V-PPase 的基因，其中 1 种基因编码 Ⅰ 型酶，叫作AtVHP1;1；另 2 种基因编码 Ⅱ 型酶，叫作AtVHP2;1和AtVHP2;2[18]。它们分布在液泡膜上的不同区域，在细胞中参与不同的生理过程。1992 年，Sarafian等[19]第一次从拟南芥中克隆出完整的液泡膜 H+-PPase cDNA 序列，命名为AVP1(Arabidopsisvacuolar H+-pyrophosphatase)，属于 K+激活型，对 Ca2+的抑制中度敏感；2000 年，Drozdowicz 等[20]在拟南芥中发现了另一种液泡膜 H+-PPase 类型，与AVP1不同的是，AVP2定位在高尔基体，属于 K+迟钝型，对 Ca2+的抑制高度敏感。研究表明AVP2与AVP1及其他植物液泡膜H+-PPase 的序列相似性只有 36%[10]，不属于同功酶[7]。此外，2000 年，Maeshima[10]提出了植物液泡膜 H+-PPase 的拓扑结构模型，在此模型中，液泡膜焦磷酸酶有 6 个液泡环、7 个胞质环和 14 个跨膜区域，同时具有 3 个高度保守的片段(CS1、CS2、CS3)，细胞质一侧的 e 环是 V-PPase 底物的结合位点(图1B)。

注：A：V-ATPase。黄色部分是V1亚基，绿色部分是V0亚基。B:V-PPase。CS1、CS2 和 CS3 代表高度保守的片段；数字代表14个跨膜结构域；字母(a、c、e、g、i、k 和 m)代表7个胞质环，字母(b、 d、f、h、j 和 l)代表6个液泡环。Note: A：V-ATPase. Yellow shows V1 subunits and green shows V0 subunits. B:V-PPase. CS1, CS2 and CS3 all represent highly conservative fragments. The numbers represent fourteen transmembrane domains. The letters above (a, c, e, g, i, k and m) represent seven cytoplasmic rings and the letters below (b, d, f, h, j and l) represent six vacuole rings.图1 液泡膜V-ATPase和V-PPase的结构模型[10,16]Fig.1 Structure model of the tonoplast V-ATPase and V-PPase[10,16].

1.2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的生理功能

液泡膜质子泵是含量丰富的液泡膜蛋白，表明其投入到液泡运输中的能量是巨大的[21-22]。液泡膜质子泵通过水解底物，将产生的 H+泵入液泡，形成跨液泡膜的 H+梯度，为溶质在胞质和液泡间的跨膜转运提供驱动力，维持胞质中各种溶质分子的相对恒定。同时，大量 H+被泵入液泡导致液泡酸化和细胞质碱化，为细胞中各种生理生化反应的进行提供适宜的内环境，保证生命活动的正常进行(图2A)[23]。此外，液泡膜质子泵 V-ATPase 和 V-PPase 的活性与植物激素密切相关，能够调控激素的分泌和在植物体内的分布进而影响植物的生长发育。研究表明，脱落酸对 V-ATPase 的转录和表达有明显的调节作用，用 50 mmol·dm-3ABA 处理黄瓜幼苗 24 h 后，液泡膜质子泵 V-ATPase 的活性显著增强[24]。Li 等[25]研究表明，AtAVP1基因能够调控生长素的运输进而影响植物的生长发育。过表达AtAVP1能够促进生长素的运输，加速细胞分裂；而缺失AtAVP1基因后，突变体中生长素运输减少，根和地上部的生长发育受到显著抑制。

注：A:pH调节。已知与建立液泡pH有关的质子泵(红色)和转运子(蓝色)。橙色表示参与调控质子泵和转运子的相关因子。CLCs是运输通道蛋白；NHXs是Na+、K+/H+反向转运体。B：有毒重金属效应。已知与重金属离子转运相关的液泡膜质子泵(红色)和转运子(蓝色)。Note: A：pH regulation. Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in establishing the vacuolar pH. Orange shows factors involved in the regulation of pumps and transporters. CLCs are Cl-, transport channel proteins and NHXs are Na+, K+/H+ antiporter. B:Toxic heavy metals transportation.Vacuolar pumps (red) and transporters (blue) known to be implicated in delivering or releasing heavy metals.图2 液泡膜质子泵和转运子参与液泡 pH 调节和有毒重金属转运[23]Fig.2 Vacuolar proton pumps and transporters involved in vacuolar pH regulation and toxic heavy metals transportation[23].

2 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 与的关系

3 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 与植物生长发育的关系

液泡膜质子泵水解底物产生的能量和 H+梯度，为各种溶质分子的逆浓度梯度运输提供驱动力[7-8]，维持细胞质溶质等的相对恒定，为植物细胞中各种生理生化反应的正常进行提供条件，对细胞的生长发育起着重要作用。Li等[25]研究表明，液泡膜 H+-PPase 功能缺失型拟南芥突变体地上部和根的生长发育均受到显著抑制，子叶畸形，多数植株因花芽分化和生殖器官的形成受到影响而不能正常结实，这些发育不正常的现象有可能是由于质子泵发生故障导致植物生长激素不正常分布所引起的。当液泡膜上编码 H+-PPase 的基因AVP1功能增强时，拟南芥植株莲座叶数目多、面积大、根系发达，且生长素运输减少。但是，也有研究发现，过表达AVP1与植株莲座叶大小和鲜重没有直接的正相关关系[32]。当 V-ATPase 的活性缺失后，液泡不能酸化，植株生长受到抑制，表现出植株矮小黄化的表型，且在突变体vha-a2vha-a3中过表达AVP1并不能增大莲座叶尺寸和生物量，对叶片细胞汁液的 pH 也没有显著影响，即在正常生长条件下，通过增强液泡膜 H+-PPase 的活性不能弥补液泡膜 H+-ATPase 活性的缺乏[32]。

4 液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 与非生物胁迫的关系

4.1 盐胁迫

盐胁迫是一种普遍存在的非生物逆境胁迫，对植物的生长发育造成不良影响。植物长期在盐渍环境中生长，必须要克服由于土壤离子浓度高造成的渗透胁迫和离子自身产生的毒害，在长期进化过程中就会形成一系列复杂的耐盐机制以适应外界环境。其中，液泡膜质子泵作为溶质进出细胞的动力开关，在胞内离子转运和植物抗盐过程中发挥着重要作用。研究表明，液泡膜上的多种离子转运载体，能够利用 H+-ATPase 和 H+-PPase 水解底物产生的 H+梯度，通过质子反向运输机制将各种阳离子转运至液泡内，维持细胞中各离子平衡，有利于植物在盐胁迫下正常生长[11-13]。

盐胁迫条件下液泡膜上的 Na+/H+逆向转运蛋白可以将胞质中过量的 Na+区隔到液泡内，减轻过多 Na+累积对细胞的毒害[33]，在这个过程中，液泡膜质子泵形成的 H+梯度是 Na+/H+逆向转运蛋白区隔离子的必要驱动力。盐胁迫条件下，液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 活性的提高是植物表现耐盐性的重要指标之一[10]。刘建新等[9]用 50、100、200、400 mmol·L-1NaCl 处理骆驼蓬幼苗，发现其根和叶片液泡膜 H+-ATPase 活性随 NaCl 浓度升高而增强，当浓度为 400 mmol·L-1时，根和叶片液泡膜 H+-ATPase 活性为对照的 2.14 和 2.64 倍。盐地碱蓬在 100 和 400 mmol·L-1NaCl 条件下处理 7 d，其叶片液泡膜 H+-ATPase 活性分别为对照的 2.71 和 2.57 倍[34]。Qiu 等[11]的研究也表明碱蓬在受 200 mmol·L-1NaCl 胁迫时，其液泡膜 H+-ATPase 和 Na+/H+反向运输体的活性增强 2～3 倍。徐呈祥等[35]对 4 个枣品种耐盐性与液泡膜质子泵活性关系的研究发现，耐盐性强的枣品种，液泡膜质子泵的活性较高，根尖细胞向质外体的“排盐”功能和向液泡内的“固盐”功能均增强，叶片细胞向质外体的“排盐”功能基本不变，而向液泡内的“固盐”功能显著增强，盐胁迫下耐盐性弱的枣品种叶片液泡膜质子泵活性下降或略有增强。液泡膜质子泵的活性对盐胁迫的响应也不尽相同。张敏等[36]研究发现，构树幼苗根和叶组织在低浓度 NaCl 处理下，根组织液泡膜 H+-ATPase 的活性提高，当 NaCl 浓度为 150 mmol·L-1时，H+-ATPase 活性有所下降。播种 8 d 的高粱种子用 NaCl 处理不同时间发现，第 1 d时根和叶鞘液泡膜 H+-ATPase 活性显著增强，第 2 d时活性降至对照水平，到第 7 d时活性明显低于对照，呈现出先升高后降低的趋势[37]。定位在液泡膜上的另一种质子泵 V-PPase 活性同样在盐胁迫下有所变化。2001 年，Gaxiola 等[38]首次将AVP1基因转入拟南芥中发现，过表达植株在 250 mmol·L-1NaCl 培养10 d 后能正常生长，叶面积和鲜重显著增加，抗盐能力增强，同时发现其AVP1蛋白水平显著高于野生型。Duan 等[39]发现，100～400 mmol·L-1NaCl 处理 5 min，过量表达液泡膜 H+-PPase 的转基因烟草叶肉细胞的存活率均比野生型更高，表现出更强的耐盐性。Krebs 等[30]用 50 和 100 mmol·L-1NaCl 处理培养4 d 的拟南芥幼苗发现，其液泡膜上 H+-PPase 的活性均增强。尽管液泡膜上的两个质子泵在响应盐胁迫方面发挥着类似的功能，但H+-ATPase和 H+-PPase 的贡献并不完全相同。Wang 等[40]研究表明，盐地碱蓬受到盐胁迫时，液泡膜 H+-ATPase 的作用更大。Yu 等[41]以耐盐型大豆为试验材料，却发现NaCl 胁迫下根细胞液泡膜H+-PPase 的活性提高而 H+-ATPase 活性降低。这可能与试验材料的种类、所选材料的发育状况及胁迫程度有关。总的来说，盐胁迫条件下，较高的液泡膜质子泵活性为 Na+区隔到液泡中提供质子驱动力，因此，盐胁迫下液泡质子泵活性的变化是衡量植物耐盐性的重要指标之一。

4.2 干旱胁迫

干旱胁迫也是自然界中普遍存在的非生物胁迫之一，是降低农作物产量和制约我国农业发展的主要环境因素之一。干旱胁迫容易造成植物脱水萎焉，渗透压失衡，严重影响植物的正常生长发育。通过提高液泡膜质子泵活性来增大细胞内的 H+跨膜梯度，利用 Na+/H+逆向转运蛋白将细胞质中更多的 Na+泵入到液泡，提高植物对盐的耐受力；另一方面，可利用 NaCl 作为溶质维持渗透势以驱动水分进入细胞，当大量 Na+被区隔到植物液泡内，细胞为维持渗透压平衡，就会累积大量的有机渗透调节物质和无机 K+，有利于增强植株的保水性，提高植物的抗旱能力[7,39]。Gaxiola 等[39]研究表明过表达AVP1基因能显著增强拟南芥的抗旱能力。在严重缺水条件下，AVP1的过表达刺激了生长素在根系中的转运并促进根系生长，这有助于转基因棉花在干旱条件下更有效地吸收水分并受到较少的损害，获得更高的生物量[42]。此外，在番茄[43]、水稻[44]、烟草[12]和玉米[45]中也证实了提高液泡膜质子泵活性能增强植物对干旱的适应能力。由此可见，液泡膜质子泵活性的高低在植物应对干旱胁迫方面扮演着重要角色，对于我国农业生产具有重要的现实意义。

4.3 金属阳离子胁迫

液泡膜质子泵作为胞质和液泡间物质交换屏障的动力开关，在区隔有害离子到液泡内，从而减少过量离子对细胞产生毒害方面发挥着重要作用。液泡膜上有大量金属离子转运蛋白，能够依赖液泡膜质子泵水解产生的能量和 H+梯度转运金属离子(图2B)[23]。镉是一种非必需的毒性很强的重金属，被认为是“五毒”重金属元素之一，可以通过与膜蛋白的竞争性结合进入植物或动物细胞体内累积[46-48]，对植物的生长发育和细胞的新陈代谢具有严重损害[49]。镉胁迫条件下植株会通过一系列的生理反应来减轻镉毒害，其中阳离子交换体(cation exchangers, CAXs)和 HMA 家族在这个过程中发挥着重要作用。CAX2编码的转运蛋白多定位于植物液泡，主要利用两个质子泵水解产生的 H+梯度促进植物胞质中的镉向液泡累积[50]。HMA 家族主要利用质子泵水解释放的能量将 Cd2+转入液泡中，其中 HMA2 和 HMA4 负责镉向木质部的转运，而 HMA3 定位在根部液泡膜上，负责将镉转运至液泡[51-53]。Ren 等[54]研究发现，当培养4周的小麦用1 mmol·L-1镉处理7 d时，叶片液泡膜 H+-ATPase 和 H+-PPase 的活性均显著提高 1.5～2.5 倍，增强了植株对镉胁迫的耐受性。液泡膜 H+-ATPase 或 H+-PPase 活性降低后，水解底物产生的 H+梯度减弱，Cd2+向液泡中的储存减少，更多的Cd2+滞留在细胞质中，从而对细胞产生毒害，表现出对镉胁迫敏感的表型，植株的生长发育受到显著抑制。此外，液泡膜上的 Zn2+/H+逆向转运蛋白对植物抵抗锌毒害具有重要作用[55-56]。当培养 13 d 的拟南芥幼苗用50 和150 μmol·L-1ZnCl2处理时，野生型的根长减少 15% 和 25%，而突变体vha-a2vha-a3的根长生长受到更严重的抑制，分别减少 35% 和 65%[32]。因此，提高植物液泡膜质子泵的活性有利于植物将过多的金属阳离子区隔到液泡中，提高植物在逆境胁迫中的耐性。

4.4 其他非生物胁迫

5 展望