番茄叶衰老诱导质体小球降解的亚细胞途径分析

李 沫，王 静，何金铭，陈雯新，刘 林，张桂芝*，赵小梅

（1.临沂大学药学院，山东临沂 276005；2.临沂大学生命科学学院，山东临沂 276005）

电子显微镜下观察叶绿体，会看到一种嗜锇颗粒[1-5]，进一步研究显示这些嗜锇颗粒是由膜脂单分子层包围三酰甘油、戊烯基醌、类胡萝卜素等中性脂核的细胞器，称为质体小球[6-8]。质体小球单分子层膜上结合着维持小球形态结构的蛋白和负责脂代谢的酶[9-10]。质体小球的产生机制是类囊体膜局部区域两分子层之间积累中性脂，中性脂积累引起膜膨大，膨大部分最终成为质体小球[10-13]。

除参与叶绿体的发育[14-17]及对多种环境胁迫的抵御[18-26]之外，质体小球的另一个重要功能是在叶绿体衰老过程中发挥解毒作用。首先，叶绿体衰老时叶绿素分解，在脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶作用下分解产生叶绿醇[27-28]，叶绿醇对细胞有毒性，必须通过代谢将毒性消减[29]，质体小球通过膜结合的酶将叶绿醇转化为α-生育酚[29-30]或脂肪酸-叶绿醇酯，并贮藏在质体小球中[10,31-32]，从而将叶绿醇毒性最小化。其次，叶绿体衰老时类囊体膜解体，半乳糖脂水解产生脂肪酸，脂肪酸有毒[33-34]，质体小球通过膜结合酶将脂肪酸转化为甘油三酯并贮藏在质体小球中[31-32]。这些源于类囊体的代谢产物在质体小球中积累，导致质体小球体积增大[35]。然而，对于这些体积增大了的质体小球的作用机理还有待于进一步研究。

番茄是广泛栽培的园艺作物，叶衰老引起胞质脂滴出现[36]，但质体小球的变化和活动还未见报道。因此，本研究对衰老叶中的质体小球进行了超微观察，以期了解质体小球的亚细胞降解途径，为进一步研究质体小球降解的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试番茄（Solanum lycopersicum）品种为‘诺亚透明粉’，源自山东省寿光市惠友种苗有限公司。

四氧化锇（分析纯），TED PELLA INC，戊二醛（分析纯）和树脂（分析纯），Structure Probe INC，磷酸氢二钠（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯）、酒精（分析纯）和丙酮（分析纯），天津市鑫铂特化工有限公司。先用磷酸盐配制0.05 mol/L 缓冲液，再用缓冲液配制2%戊二醛溶液和1%四氧化锇溶液。

1.2 仪器与设备

透射电子显微镜为JEOL 1220（JEOL），切片机为ULTRACUT R（Leica）。

1.3 方法

实验于2017—2018 年进行，每年1 月下旬温室育苗，4 月中旬露地定植，6 月下旬取成熟叶和衰老叶进行超微观察。图1 中成熟叶的叶片充分扩展（图1A），衰老叶则明显失绿（图1B）。

图1 番茄成熟叶（A）和衰老叶（B）Fig.1 Mature（A）and senescent（B）leaves of tomato

1.4 透射电子显微技术

从大田植株切取小块叶片，立即浸没在2%戊二醛固定液中，在实验室内切除叶片受伤边缘，中央部分切成小于1 mm×1 mm 的小块，放回2%戊二醛固定液中继续固定，时间总计达12 h，期间抽出叶组织内的气体。样品经0.05 mol/L 磷酸缓冲液洗涤后，用1%四氧化锇溶液固定2 h。之后用乙醇脱水，再用丙酮置换出样品中的乙醇，将样品包埋于Embed-812 树脂中，切片，厚度为60 nm。切片用5%醋酸铀染色10 min，再用0.1%柠檬酸铅染色2 min，透射电子显微镜下观察质体小球[5,36,38]。

1.5 数据处理

用SPSS 数据分析软件对叶衰老前后的质体小球数量、直径和体积进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 叶衰老前后质体小球大小和数量变化

表1 叶衰老前后叶绿体每个切片上质体小球数量、直径和体积Table 1 Plastoglobule number,diameter and size per section of the chloroplast in leaves before and after senescence

表1 显示了叶衰老前后叶绿体切片上质体小球的数量、直径和体积。直径从0.08～0.13 μm，平均直径（0.1±0.03）μm。按照直径平均值，成熟叶质体小球的体积平均为6.7×10-4μm3。

图2 成熟叶中的质体小球Fig.2 Plastoglobules in mature leaves

图2 为番茄成熟叶的叶绿体，叶绿体不同切片上质体小球数量差异表明质体小球在叶绿体内的分布极不均匀，番茄成熟叶叶绿体每张切片上都含有质体小球，但不同切片上质体小球数量差别很大，少者仅几个，多者十几个，质体小球电子密度大，呈现为黑色颗粒。

由表1 知，衰老叶不同切片上质体小球数量差异较大，少至2 个，多达7 个，平均（5.00±1.8）个。衰老叶叶绿体中的质体小球数量与成熟叶基本没有差别，但是质体小球的体积显著增大，直径为0.42～0.80 μm，平均直径（0.56±0.12）μm，约为成熟叶质体小球平均直径的5.6倍。按照直径平均值，衰老叶质体小球体积平均为1.1×10-1μm3，较叶衰老前明显增大。

与成熟叶相似，衰老叶叶绿体每张切片上也都含有质体小球（图3、4），与成熟叶相比，衰老叶的质体小球电子密度大大降低，除表面仍然呈黑色外，内部变浅至灰色（图3），仅个别质体小球保持较大的电子密度（图4A～C）。

图3 衰老叶中的质体小球Fig.3 Plastoglobule in senescent leaves

图4 衰老叶质体小球的降解Fig.4 Plastoglobule degrdation in senescent leaves

2.2 衰老叶中质体小球的活动

衰老叶中的质体小球有两种值得注意的活动。第一种是向叶绿体外分泌，如图3A 所示，有一个胞质脂滴与叶绿体相连，虽然没有规则的形状，但具有与质体小球相似的电子密度，根据密切的位置关系和相似的电子密度判断，这个胞质脂滴是刚从叶绿体内分泌出来的质体小球。在图3B 中，叶绿体中央的质体小球具有圆形轮廓，而叶绿体边缘的质体小球失去圆形轮廓，呈弯月形，显示是不完整的质体小球，弯月形的凹面正对着叶绿体外的胞质脂滴。胞质脂滴紧贴着叶绿体，并向着叶绿体内弯月形质体小球的凹面突起，间隙极小，显示质体小球正在向叶绿体外分泌，胞质脂滴就是从叶绿体分泌出来的质体小球。胞质脂滴没有固定的形状，与质体小球形成鲜明对比。质体小球从相邻叶绿体分泌出来后立刻融合成一个胞质脂滴，这与质体小球明显不同（图3B）。较大的胞质脂滴，尤其是刚从叶绿体分泌出来的较大脂滴，其电子密度与质体小球类似，而较小的脂滴，尤其不与叶绿体接触的胞质脂滴，通常具有很高的电子密度（图4B）。胞质脂滴会出现在中央大液泡中，在液泡内发生降解（图4A、B）。观察表明细胞质中没有包裹着脂滴的自噬小体。脂滴往液泡内突入（图3A），显示脂滴直接被液泡吞噬。与衰老叶不同，成熟叶没有质体小球向叶绿体外分泌的活动，细胞质中也没有胞质脂滴（图2），显示质体小球向叶绿体外分泌并进入液泡的活动只在衰老叶内发生。

质体小球的另一种活动是它在叶绿体内发生原位降解。质体小球降解时，伴随出现一个电子密度较低或透明的斑（图3A、B），然后透明斑不断扩大（图4B～D），显示降解从一点开始，向四周扩展。随着体积不断增大，透明斑显示不同的形状，如图4B 所示，透明斑变成了圆形，而在图4C 和4D 中，透明斑变成了凸透镜形。圆形透明斑套在质体小球内部（图4B），凸透镜形透明斑则与质体小球并列（图4C、D）。不同的位置关系是切片角度不同造成的，如果切片方向与连线平行，则透明斑与质体小球并列（图4C、D）；如果切片方向与透明斑和质体小球中心连线垂直，则透明斑位于质体小球内部（图4A、B）。透明斑与质体小球接触面上质体小球凹陷，而透明斑凸起，透明斑与质体小球构成椭球形（图4C、D）。透明斑与叶绿体基质之间的界面上有膜（图4C），表明透明斑实际上是小泡。

图5 质体小球（PG）降解与小泡（V）关系示意图Fig.5 Diagram of the association between plastoglobule (PG)and vesicle (V)

图5 显示了质体小球（PG）降解与小泡（V）关系，由图知，小泡随着质体小球的降解而不断增大；降解程度越大，小泡就越大（图5）。在叶绿体切片上，不是所有质体小球都发生原位降解，表明质体小球的原位降解是不同步的。

3 讨论

本研究显示，番茄衰老叶中质体小球显著增大，但数量并无明显变化，体积增大了的质体小球接下来进行两种活动：一是向叶绿体外分泌，然后进入液泡内降解；二是在叶绿体内发生降解。脂滴在叶绿体内的降解也称原位降解[37-38]。

番茄衰老叶中质体小球分泌到叶绿体外成为胞质脂滴，来自质体小球的胞质脂滴形状不规则。脂滴的形状取决于其表面上的结构蛋白组分，结构蛋白组分改变，脂滴形状就会随之改变[39]。质体小球表面约有30 种蛋白质，多数为结构蛋白，少数为酶[16,19,40]。其中含量最为丰富的是纤维蛋白，属于结构蛋白，以纤维形式存在于质体小球表面，形成质体小球疏水核与叶绿体基质亲水环境之间的相容性界面，从而维持质体小球结构的稳定性，防止质体小球彼此合并[39,41-42]。番茄叶衰老过程中，质体小球从叶绿体分泌出来就失去了原来的形状，而且彼此易于合并，与质体小球形成鲜明对比，这意味着质体小球在分泌过程中失去了相关的结构蛋白，这些结构蛋白的缺失使得离开叶绿体的质体小球无法维持稳定形状和彼此独立，相互之间极易合并。

番茄衰老叶内，质体小球从分泌到进入中央大液泡，体现了降解的液泡途径。质体小球向液泡外分泌而成为胞质脂滴，但细胞质中没有积累大量胞质脂滴，这与之前的观察结果类似[36]。可能质体小球分泌到叶绿体外之后不久就进入液泡内降解，所以胞质脂滴不会大量积累。细胞组分进入液泡内发生降解的过程属于自噬[43]，自噬分为巨自噬和微自噬，先形成自噬小体再被液泡吞噬称为巨自噬，直接被液泡吞噬称为微自噬[44]。番茄衰老叶内没有观察到包含脂滴的自噬小体，脂滴直接被液泡吞噬，所以脂滴进入液泡的过程属于微自噬。研究表明叶衰老后自噬相关基因和定位于液泡的的脂酶基因表达水平急剧升高[45-48]，为脂滴降解的液泡途径提供了分子基础。要了解番茄衰老叶内自噬相关基因以及定位于液泡的脂酶基因的表达水平变化情况，还需要进一步探索。

番茄衰老叶绿体内质体小球降解伴随透明斑的发生，暗示质体小球降解遵循一条小泡途径。利用蛋白质组技术在质体小球上发现了PES1 和PES2[9]，两个属于酯酶/脂肪酶/硫酯酶家族的成员。这两种酶都具有二酰甘油酰基转移酶活性，催化脂肪酸与二酰甘油反应生成三酰甘油，脂肪酸与叶绿醇反应生成脂肪酸叶绿醇酯[31-32]。在衰老叶中，这两种酶的表达水平急剧升高[31]。然而，质体小球上缺少负责甘油三酯水解的脂酶[9]。如果质体小球在叶绿体内降解，一个关键问题是，脂酶从何而来。首先考虑一下位于细胞质基质中的胞质脂滴，其表面也没有脂酶，其降解遵循液泡途径或乙醛酸循环体途径[49-50]。在液泡途径中，液泡为脂滴提供脂酶；在乙醛酸循环体途径中，乙醛酸循环体将脂酶输送到脂滴表面[49]。乙醛酸循环体途径发生于发芽种子中。油性种子发芽时，乙醛酸循环体与脂滴接触，从而将脂酶呈递到脂滴表面，脂酶催化贮藏脂水解，产生脂肪酸[49]。游离脂肪酸有毒[33-34]，过氧化物酶体将其收集，通过β-氧化途径和乙醛酸循环途径将脂肪酸转化成无毒性的琥珀酸，琥珀酸离开乙醛酸循环体进一步转化成可运输的糖，供幼苗生长所需[49]。脂酶要作用于质体小球，需要先跨越叶绿体膜，再以某种方式传递到质体小球表面。本研究显示，番茄质体小球在叶绿体内降解时伴随产生透明斑，透明斑有膜边界，实质上是一种小泡。小泡与质体小球的密切联系让人联想到种子发芽时乙醛酸循环体与胞质脂滴的相互作用，产生对小泡是否像乙醛酸循环体那样参与质体小球降解的猜测。与乙醛酸循环体比较，小泡有一个特别之处，即它的体积随着质体小球的降解而不断增大。本研究为质体小球降解的生化分析提供了基础。

4 结论

显然，叶衰老诱导质体小球体积增大，并导致质体小球通过两条亚细胞途径降解：一条途径是质体小球分泌到叶绿体外之后再转运到液泡内，在液泡内降解；另一条途径是在叶绿体内通过小泡的参与而降解，表现为正在降解的质体小球总是与小泡相联系。小泡途径降解的分子机制还不清楚，是未来需要解决的问题。了解质体小球降解的分子机制有助于探索叶片的衰老机制，并进一步实现对衰老叶大分子养分的回收利用。