慢性心衰大鼠下丘脑室旁核瞬时外向钾通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表达促进肾交感神经兴奋性*

马柳一，　尹玉洁，　位　庚，　李红蓉，　张军芳，　刘　焕，　贾振华,3△

(1河北医科大学，河北 石家庄 050017； 2河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，河北 石家庄 050035； 3河北医科大学附属以岭医院心血管科(国家中医药管理局中医络病学重点学科)，河北 石家庄 050091)



慢性心衰大鼠下丘脑室旁核瞬时外向钾通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表达促进肾交感神经兴奋性*

马柳一1，尹玉洁1，位庚1，李红蓉1，张军芳2，刘焕1，贾振华1,3△

(1河北医科大学，河北 石家庄 050017；2河北以岭医药研究院，国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，河北 石家庄 050035；3河北医科大学附属以岭医院心血管科(国家中医药管理局中医络病学重点学科)，河北 石家庄 050091)

[摘要]目的： 观察慢性心衰大鼠下丘脑室旁核内瞬时外向钾通道蛋白Kv4.2和Kv4.3的变化及其对交感神经活性的影响。方法: 采用冠状动脉左前降支结扎术建立大鼠心衰模型或假手术模型，造模4周后超声心动图测定心功能；酶联免疫吸附法测定血浆去甲肾上腺素(NE)及血清N端前脑钠肽(NT-proBNP)含量；Western blot和real-time PCR法测定室旁核内Kv4.2和Kv4.3的表达情况；室旁核部位注射钾通道阻滞剂4-氨基吡啶(4-AP)，电生理记录仪记录血压、心率和肾交感神经放电的变化。结果: 与假手术组比，心衰组大鼠心功能明显降低，血浆NE及血清NT-proBNP明显升高，室旁核内Kv4.2和Kv4.3表达明显下调；注射4-AP后导致血压、心率和交感神经放电升高，但心衰组的升高幅度小于假手术组。结论: 心力衰竭时室旁核内Kv4.2和Kv4.3表达下调并伴有交感神经放电增加，促进心衰进展。

[关键词]慢性心力衰竭； 交感神经； 下丘脑室旁核； 瞬时外向钾通道蛋白

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是指由于心肌收缩力降低，使心输出量不能满足机体代谢的需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征。持续的交感神经过度激活是CHF的重要特征，其中枢调控机制是CHF发生发展的重要因素[1]。CHF时中枢神经元兴奋性升高，交感神经活性明显增强[2]。瞬间外向钾通道广泛分布于神经元和心肌细胞上，具有快速激活、快速失活及对4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)敏感等特性，介导动作电位复极化早期外向钾电流，在调节中枢神经元兴奋性和突触传递以及维持神经元正常生理功能方面发挥重要作用[3]。参与CHF时交感神经激活的主要心血管中枢包括下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)、延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla，RVLM)等。Gao等[4]发现心衰模型大鼠检测到RVLM区域存在瞬时外向钾通道Kv4.3 mRNA表达下调，膜片钳技术检测到RVLM区域神经元兴奋性升高，当给予钾通道阻滞剂4-AP时引起剂量依赖性的外周交感神经放电增强。而在心衰发病过程中PVN部位瞬间外向钾通道对外周交感神经的调节尚不清楚。本研究构建慢性心衰大鼠模型，探讨PVN部位瞬间外向钾通道的变化对肾交感神经活性(renal sympathetic nerve activity，RSNA)的影响及其在CHF发生发展机制中的作用。

材料和方法

1材料和动物

1.1实验动物成年雄性SD大鼠，40只，8周龄左右，体重200～220 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[编号SCXK(京)2012-0001]。饲以标准饲料，自由进食饮水，光照12 h/d，温度20～23 ℃，相对湿度40%～60%。

1.2试剂和仪器钾通道阻滞剂4-AP、滂胺天蓝(Sigma)；人工脑脊液(arificial cerebrospinal fluid, ACSF) 购自湖北英创生物科技有限公司；大鼠去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和N端前脑钠肽(NH2-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)酶联免疫吸附试剂盒(CUSABIO)；小鼠抗大鼠Kv4.2和Kv4.3抗体(Abcam)；HX-300动物呼吸机、脑立体定位仪、ZH-RXZ型柔性颅骨钻(淮北正华生物仪器有限公司)；PowerLab信号采集系统(Ad Instruments)；DP301生物电放大器(Warner Instruments)；玻璃分针及铂丝电极(自制)。

2方法

2.1心衰模型的建立及分组大鼠随机分为2组：假手术(sham)组和CHF组。用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，经口腔气管插管连接小动物呼吸机进行机械通气(潮气量30～32 mL，呼吸比1∶2，呼吸频率90次/分)。撕开胸膜，暴露心脏，待大鼠心电、呼吸平稳后，在无菌调节下，经左胸骨旁第2～3肋沿着肋间隙切开皮肤(切口约1 cm左右)，经切口处放入小动物开胸器，打开心包，推开胸腺，轻轻拨开左心耳，于左心耳下距主动脉根约1.5 mm处结扎左冠状动脉前降支(假手术组只穿线不结扎)。沿肋骨对缘缝合，关闭胸腔，分层缝合胸壁。大鼠恢复自主呼吸后，拔出气管插管，腹腔注射青霉素。待大鼠苏醒后放入笼中正常饲养。

2.2大鼠心功能测定术后喂养4周超声测定心功能变化，采用射血分数(ejection fractions，EF)<42%作为评定心力衰竭的标准[5]；取下大鼠心脏及肺脏称重，心重和肺重与大鼠体重的比值即为心重指数和肺重指数。

2.3大鼠血浆NE及NT-proBNP含量的检测腹主动脉采血，抗凝处理，4 ℃、3 000 r/min，离心15 min，分别取上清于EP管中，-80 ℃冷冻保存备用。ELISA法测定血浆NE及血清NT-proBNP水平，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

2.4Western blot实验大鼠断头、取脑后依据大鼠脑定位图谱于PVN区域打孔，提PVN至EP管中[6]，取组织加入裂解液中，冰浴匀浆，充分裂解，离心收集上清，用Nanodrop 2000分光光度计进行蛋白定量。待冷却，进行电泳分离蛋白。凝胶电泳完毕后对凝胶进行半干转膜。转膜完毕，封闭液中封闭2 h。将封闭后的PVDF膜置入TBST稀释(1∶1 000)的I抗溶液中，4 ℃缓慢摇动过夜。取出PVDF膜放入盛有适量TBST的平皿中，室温洗膜。将PVDF膜置入适量以TBST 1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的II抗溶液中，于室温反应2 h。抗体结合区带用化学发光法检测。

2.5Real-time PCR取组织于冰浴匀浆器中，加入1 mL TRIzol，迅速研磨成匀浆液，加入200 μL氯仿振荡30s，冰上放置5 min、4 ℃、12 000 r/min，离心10 min，取上层水加入等体积的异丙醇，-20 ℃静置2 h。4 ℃、12 000 r/min，离心20 min，弃上清，加入1 mL 75%乙醇，轻轻混匀，4 ℃、12 000 r/min，离心10 min，加入20 μL DEPC处理的去离子水溶解沉淀，-80 ℃保存备用。提取后对RNA纯度与完整性进行检测；反转录，SYBR Green荧光定量PCR的检测；进行实时荧光定量PCR结果分析，最后以GAPDH为内参照基因对比，得到目的基因的相对定量 (relative quantitation，RQ)值，将RQ值用于统计分析。

2.6血压、心率和肾交感神经活性的测定每组实验大鼠随机抽取6只，10%水合氯醛腹腔麻醉后，将大鼠固定于手术台上，沿股动脉走向纵向切开皮肤，用蚊式钳钝性分离组织，暴露左侧股静脉，右侧股动脉，用眼科镊或玻璃分针顺着血管走向钝性分离，行左侧股静脉插管以静脉给药，右侧股动脉插管，导管接压力换能器，与桥式放大器相连，PowerLab系统采集信号，持续监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)、心率(heart rate，HR)和RSNA。之后动物取俯卧位，利用门齿钩、双侧耳棒将大鼠头部固定于脑立体定位仪上，沿矢状缝做皮肤切口暴露颅骨，调整前囟和后囟至同一水平。PVN定位：B=1.8 mm，L=0.4 mm，H=7.9 mm[7]。B表示前囟向后，L表示正中线左右旁开，H表示硬脑膜下深度。电钻颅骨钻孔，动物取右侧卧位，经腰部纵行切口沿腹膜后路径暴露左侧肾脏，在解剖显微镜下找到左侧肾动脉和肾神经，分离肾交感神经，挂于双极珀金丝银丝电极，滴加37 ℃石蜡油保持湿润，接生物电放大器，PowerLab生物信号系统采集信号。在PVN部位先后微量注射200 nL的ACSF及等体积不同浓度的(2、4、8 nmol/μL)钾通道阻滞剂4-AP，每次给完药后开始计时，连续观察微量注射ACSF及药物对MAP、HR、RSNA的影响，每次给药时间间隔30 min。而后将体积50 nL的滂胺天蓝缓慢注入PVN，取出脑组织冰冻切片观察药物是否进入PVN，定位不准确的舍去。

3统计学处理

采用SPSS 19.0软件处理，所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，RSNA对不同剂量药物的反应以在基线基础上的变化百分率表示，而血压和心率对不同种类和不同剂量药物的反应则以实测值和基线值之差(即变化值)表示。2组内数据分析使用配对设计t检验，2组间数据分析使用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1大鼠心功能评价

左冠脉结扎术后4周，超声检查可见CHF组大鼠存在不同程度的心尖区或心前壁变薄，室壁运动减弱。结果显示，与sham组相比，CHF组左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic dimension，LVDd)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic dimension，LVDs)、左室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volume，LVVd)和左室收缩末期容积(left ventricular end systolic volume，LVVs)明显增高，EF及短轴缩短率(fractional shortening，FS)明显降低，心重指数(heart weight/body weight，HW/BW)和肺重指数(lung weight/body weight，LW/BW)明显升高(P<0.01)，见表1。

表1假手术组和心衰组大鼠超声心动图指标、心重指数和肺重指数结果比较

Table 1.The comparison of echocardiogram, HW/BW and LW/BW of sham-operated and CHF rats (Mean±SD.n=9)

IndexShamCHFLVDd(mm)6.14±1.049.73±0.46**LVDs(mm)3.54±0.748.71±0.60**LVVd(mL)0.58±0.271.93±0.28**LVVs(mL)0.12±0.061.42±0.28**EF(%)78.22±8.3326.11±6.35**FS(%)42.44±7.9710.33±2.78**HR(beats/min)352.11±70.13382.89±42.56HW/BW(mg/g)2.62±0.273.16±0.13**LW/BW(mg/g)3.33±0.384.94±0.57**

**P<0.01vssham group.

2ELISA法测定血浆中NE水平及血清NT-proBNP水平

与假手术组比较，CHF组血浆NE及血清NT-proBNP含量均显著升高(P<0.01),见表2。

表2大鼠血浆NE及血清NT-proBNP 检测结果的比较

Table 2.The changes of NE, NT-proBNP in the rats with different treatments (Mean±SD.n=9)

GroupNE(μg/L)NT-proBNP(ng/L)Sham2.28±0.12244.43±16.80CHF3.33±0.40**286.70±13.61**

**P<0.01vssham group.

3Western blot和 real-time PCR检测Kv4.2、Kv4.3的表达

利用Western blot和 real-time PCR检测Kv4.2、Kv4.3表达，与sham组比较，CHF组Kv4.2、Kv4.3表达蛋白及mRNA均明显降低，见图1。

Figure 1.The protein (A) and mRNA (B) expression of neuronal Kv4.2，Kv4.3 in the punched paraventricular nucleus tissues measured by Western blot and real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vssham.

图1Western blot和real-time PCR检测下丘脑室旁核Kv4.2、Kv4.3的表达情况

4微量注射4-AP后大鼠血压、心率和肾交感神经放电变化情况

与ACSF组比较，sham组和CHF组大鼠室旁核内注射钾通道阻滞剂4-AP(2、4、 8 nmol/μL)剂量依赖性地导致血压、心率、交感神经放电的显著增强(P<0.05)；但与sham组比较，CHF组血压、心率、交感神经放电升高幅度显著减小(P<0.01)，见图2。

讨论

本研究采用SD大鼠冠状动脉左前降支结扎导致心梗后心衰模型，4周后可见CHF组HW/BW和LW/BW明显升高，有统计学显著性；超声心动图显示CHF组LVDd、LVDs、LVVd和LVVs明显增高，EF和FS明显降低，差异有统计学显著性；NT-proBNP是临床上评定CHF的金标准，CHF组NT-proBNP明显高于假手术组，差异有统计学显著性。表示CHF模型制作成功。

CHF是心脏泵血功能障碍与代偿性激活的神经体液因子相互作用为特征的临床综合征，是多种心血管疾病的终末阶段。中枢神经系统的激活是CHF发生发展的重要机制，主要通过影响外周交感神经活动加重心衰进展[1]。钾离子通道的多样性决定了中枢神经元放电模式及生理功能的多样性[8-9]。瞬时外向钾通道通过影响动作电位的形成及形态，调节动作电位的频率，调整静息膜电位等影响神经功能活动而受到关注[10-11]。中枢神经系统Kv4.x通道是调节瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，Ito)主要成分[12]。3个不同的基因编码Kv4.x家族，包括Kv4.1、Kv4.2和Kv4.3，后两者是中枢部位调节神经元兴奋性的主要亚基成分[13]。Gao等[4]发现CHF大鼠中枢RVLM部位Kv4.3蛋白表达量下降；有趣的是，研究者在CHF病人心肌细胞及高血压模型大鼠心肌细胞也发现同样现象[14-15]。这些数据表明心衰或高血压状态下外周和中枢组织存在钾通道蛋白表达的下调。本实验通过Western blot和real-time PCR实验发现心衰大鼠PVN部位钾通道的Kv4.2和Kv4.3蛋白和mRNA表达较假手术组明显降低，与上述报道一致。PVN是中枢内的整合区域，是调节交感神经活动的关键脑区，激活PVN会导致血压的升高和交感神经活动的增强。有研究发现高血压大鼠PVN部位由钾通道介导的电流下调，而钙通道介导的电流上调，这种电流之间的翻转增强了细胞膜的兴奋性[16]。因此我们推测心衰时PVN部位Kv4.2和Kv4.3的下调降低了Ito，导致了神经细胞兴奋性的增强。

Figure 2.The changes of MAP, RSNA, HR after microinjection of 4-AP into the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsACSF;##P<0.01vssham.

图2微量注射4-AP后大鼠平均动脉压、心率和肾交感神经放电活性改变的比较

为了验证钾通道蛋白Kv4.2和Kv4.3低表达在慢性心衰中的作用，本实验大鼠PVN微量注射瞬时外向钾通道蛋白阻滞剂4-AP后，引起剂量依赖性血压、心率、肾交感神经放电增强，这些数据表明降低PVN部位钾电流会造成交感神经活性增强。值得注意的是，与假手术组相比，CHF组PVN注射4-AP后血压、心率、肾交感神经放电升高幅度显著降低，提示CHF时PVN的钾通道蛋白低表达造成的交感神经去抑制可能是参与CHF交感神经兴奋性增强的作用机制之一。

综上所述，慢性心衰时交感中枢部位瞬时外向钾离子通道表达量的下调造成的PVN神经元自主性放电及兴奋性的增强可能是心衰交感神经兴奋性增强的作用机制之一，这为慢性心衰的病理生理研究和治疗提供了依据。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

Downregulated transient outward potassium channel protein Kv4.2 and Kv4.3 expression in PVN contributes to sympathoexcitation in rats with chronic heart failure

MA Liu-yi1, YIN Yu-jie1, WEI Geng1,LI Hong-rong1, ZHANG Jun-fang2, LIU Huan1, JIA Zhen-hua1, 3

(1HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China;2DepartmentofCardiology,YilingMedicalInstituteofHebeiProvince,KeyLaboratoryofStateAdministrationofChineseMedicine(Cardio-cerebralVascularCollateralDisease),Shijiazhuang050035,China;3DepartmentofCardiology,YilingHospitalofHebeiMedicalUniversity(CollateralDiseaseTheoryKeyDisciplineofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine),Shijiazhuang050091,China.E-mail:jiatcm@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the transient outward potassium channel protein expression in paraventricular nucleus (PVN) and its contribution to renal sympathetic nerve activity (RSNA) in rats with chronic heart failure (CHF).METHODS: A rat model of CHF was prepared by acute myocardial infarction that was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery. Four weeks after heart failure, echocardiogram was applied to identify the CHF model and plasma norepinephrine (NE), serum NH2-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT-proBNP) were detected by ELISA. The expression of ransient outward potassium channel proteins Kv4.2 and Kv4.3 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. The mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and RSNA were measured in anesthetized rats with PVN microinjection of potassium channel blockers 4-AP. RESULTS: In CHF group, the rat cardiac function and Kv4.2 and Kv4.3 expression in PVN were obviously lower while plasma NE and serum NT-proBNP were obviously higher than those in sham group. Microinjection of 4-AP into PVN induced an increase in MAP, HR and RSNA in both sham and CHF rats, while the CHF rats exhibited smaller responses to 4-AP than sham-operated rats.CONCLUSION: Downregulation of Kv4.2 and Kv4.3 expression in the PVN may be a potential mechanism for sympathoexciation in the rats with chronic heart failure.

[KEY WORDS]Chronic heart failure; Sympathetic nervous; Hypothalamic paraventricular nucleus; Ransient outward potassium channel protein

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.022

[中图分类号]R541.6； R363

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 0311-66703020; E-mail: jiatcm@163.com

*[基金项目]国家重点基础研究发展计划(973计划)(No.2012CB518606)；国家自然科学基金资助项目(No.81273978)

[收稿日期]2015- 10- 28[修回日期] 2015- 12- 11

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0522- 06

杂志网址： http://www.cjpp.net

·短篇论著·