FOXQ1基因介导了Shh诱导的SW480 细胞血管生成及增殖

朱双伟，　李相述，　彭旭东，　陈　诚，　陈小龙，　魏正强

(重庆医科大学附属第一医院胃肠外科, 重庆 400016)



FOXQ1基因介导了Shh诱导的SW480 细胞血管生成及增殖

朱双伟，李相述，彭旭东，陈诚，陈小龙，魏正强△

(重庆医科大学附属第一医院胃肠外科, 重庆 400016)

[摘要]目的： 探讨FOXQ1基因沉默对大肠癌SW480细胞血管生成及增殖能力的影响及其在Sonic hedgehog(Shh)通路中的作用。方法：以携带FOXQ1-shRNA的慢病毒载体感染SW480细胞，将细胞株分为FOXQ1-shRNA和NC-shRNA组，利用脐静脉内皮细胞系926细胞行体外血管形成实验，荧光显微镜观察2组细胞血管形成能力，MTT、倍增时间、平板克隆形成实验检测2组细胞的存活率，real-time PCR、Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)-A、基质金属蛋白酶(MMP)2和cyclin D1 mRNA和蛋白水平。利用重组Shh蛋白诱导上述2组细胞，观察诱导前后细胞存活率及血管形成能力的变化，检测上述分子的表达差异。结果：与NC-shRNA组细胞相比，FOXQ1-shRNA组细胞的体外血管形成能力降低，而存活率无明显变化，real-time PCR及Western blot显示FOXQ1基因沉默后，VEGF-A和MMP2的表达下调，cyclin D1表达无显著差异。与NC-shRNA组比较，重组Shh蛋白诱导的FOXQ1-shRNA体外血管形成能力更低，存活率无明显差异。结论：FOXQ1基因介导了大肠癌SW480细胞的血管形成能力，对存活率无明显影响，并且可能受到Shh通路调控。

[关键词]FOXQ1基因； Sonic hedgehog； 大肠癌； 细胞增殖； 血管生成

结直肠癌在世界多数国家的发病率呈持续上升趋势[1]。结直肠癌细胞的恶性行为包括过度异常的增殖、血管形成能力、侵袭迁移、对药物敏感性的变化等，涉及Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β/Smads等多种信号通路及转录因子(snail、GLI2等)[2-4]。

FOXQ1基因是叉头框(forkhead box，FOX)基因家族的重要成员之一[3]。近年来，其作为原癌基因的角色逐渐被人们认识，其与信号通路间的相互作用与肿瘤密切相关[4-5]。研究表明在大肠癌组织中FOXQ1基因表达明显增高，并与肿瘤的分期及转移相关，这提示其可能参与了结直肠癌发生发展，但具体机制尚待进一步研究[6-7]。我们前期的实验已证实，其与大肠癌上皮间质转化关系密切[8-9]，而FOXQ1是否参与了大肠癌细胞的血管形成及增殖尚待进一步研究。

Sonic hedgehog(Shh)信号通路在胚胎发育、细胞分化、维持组织极性及组织损伤与修复过程中发挥重要作用，在正常成熟组织中处于失活状态，近年来在许多肿瘤中发现Shh信号通路异常激活，参与调控肿瘤的发生发展及恶性生物学行为的维持[10-11]。研究表明Shh的表达与大肠癌的关系密切，参与了大肠癌细胞的增殖、血管形成及远处转移[12-13]。FOX为近年来新发现的转录因子超家族，其中有许多受到Shh通路的调节，参与肿瘤的发展[14]，FOXQ1与Shh信号通路的关系待进一步研究。

本研究利用基因沉默技术沉默大肠癌细胞SW480的FOXQ1基因，观察FOXQ1基因沉默对SW480细胞血管形成和存活率的影响。为了探索FOXQ1是否介导了Shh通路所诱导的恶性行为，我们采用重组Shh蛋白诱导SW480 细胞，观察诱导前后细胞的血管形成及存活率的改变。

材料和方法

1材料

大肠癌SW480细胞株、脐静脉内皮细胞系926细胞株(EA.hy926)由重庆医科大学附属第一医院实验研究中心保存；RPMI-1640培养基、胎牛血清为HyClone产品；FOXQ1-shRNA沉默慢病毒载体、阴性对照(negative control,NC)慢病毒载体均购于上海纽恩生物科技公司；重组蛋白Shh购于PeproTech；real-time PCR相关试剂盒及扩增引物均为TaKaRa产品；兔抗人FOXQ1蛋白抗体为Santa Cruz产品；兔抗人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)-A、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗体为武汉三鹰公司的产品；鼠抗人GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠 II 抗、兔抗兔 II 抗均为ABgent产品；Western blot相关试剂盒均购于上海碧云天公司。

2实验方法

2.1细胞培养SW480细胞和EA.hy926细胞在含12%胎牛血清的RPMI-1640培养基、5% CO2、37 ℃的培养箱里培养。重组蛋白Shh诱导细胞的浓度为10 μg/L，诱导时间为48 h。

2.2慢病毒转染及有效沉默序列的筛选用于转染的携带FOXQ1-shRNA(3种)及阴性NC-shRNA慢病毒沉默序列分别如下：FOXQ1-sh1为5′-CGCGGACUUUGCACUUUGA-3′，FOXQ1-sh2为5′-CCAGCTCCTTCGCCATCGACA-3′，FOXQ1-sh3为5′-GGCUGGCUUCAUCCACUGC-3′，NC-shRNA为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。消化调整细胞浓度为2×108/L，取每孔1 mL种于6孔板中(分阴性组、sh1组、sh2组和sh3组，每组3个复孔)，摇匀后常规培养。14 h后 以MOI=30分别加入上述4种病毒载体，并每孔加入终浓度为5 mg/L的转染增敏剂polybrene，16 h后换液。转染72 h后于荧光显微镜下观察荧光强度，明确转染效率。消化扩大培养后提取总RNA和总蛋白检测沉默效果，选取效果最好的慢病毒载体为后续转染载体，将细胞分为FOXQ1-shRNA组(感染FOXQ1-sh慢病毒的SW480细胞)和NC-shRNA组(感染阴性对照序列的SW480细胞)。采用NC-shRNA序列转染EA.hy926细胞，除铺板是密度为每孔5×104外，其余方法同上。

2.3Real-time PCR法检测FOXQ1、VEGF-A、MMP2和cyclin D1 mRNA的水平检测用TRIzol法提取总RNA，逆转录得到cDNA，用CFX96扩增仪分别扩增各目的基因。扩增条件为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环; 最后72 ℃ 10 min。各目的基因引物序列见表1。

表1　各目的基因的引物序列

2.4FOXQ1、VEGF-A、MMP2和cyclin D1蛋白水平的检测提取总蛋白并测浓度，电泳时每个泳道分别加入50 μg蛋白，电泳时间约为2 h。根据各目的蛋白分子量切胶，并转至PVDF膜上，TBST洗膜后5%脱脂牛奶封闭2 h，分别用GAPDH(1∶2 000)、FOXQ1(1∶2 000)、VEGF-A(1∶500)、MMP2(1∶500)、cyclin D1(1∶500) I抗，4 ℃过夜。37 ℃复温2 h后，分别用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠、兔抗兔 II 抗，37 ℃孵育2 h。利用ECL发光液显色，Fusion软件分析光密度。

2.5体外血管形成实验取各组细胞不换液连续培养3 d后的培养基1 mL，再与1 mL完全培养基混匀后加入6孔板中。取2.5×105个NC-shRNA病毒感染的EA.HY926细胞接种于上述培养瓶，常规培养48 h后，显微镜下观察血管形成情况，摄片，计数。

2.6MTT法检测细胞存活率和生长曲线取对数生长期的2组细胞，消化并计数，制成1×107/L细胞悬液，每孔接种200 μL至96孔板内，设6个平行孔。即刻、24 h、48 h、72 h每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，4 h后去上清液，每孔加150 μL DMSO，在全波长自动酶标仪570 nm处比色测吸光度(A)值。以横坐标为时间，纵坐标为吸光度值，绘制3组细胞生长曲线。倍增时间：取2×103细胞加入培养瓶，培养7 d，每组重复3次。第7天消化、计数，计算倍增时间(h)=7×[lg2/(lgN7-lgN0)]×24(N0、N7分别为首次、7 d时的细胞数)。平板克隆形成实验：取状态良好的细胞，用0.125%胰蛋白酶消化吹匀，计数，取2 000个细胞接种于6孔培养板中，每组设3个重复孔，常规培养15 h。4%多聚甲醛固定后，结晶紫染色，用CanoScan 9000F MarkII 扫描仪进行集落扫描，计数每孔集落数(以大于50 个细胞聚集计为1 个集落)。

3统计学处理

采用SAS 8.0统计软件分析数据，重复测量数据采用重复测量的方差分析；多组之间的均数比较采用完全随机设计的方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；所有数据用均数±标准差(mean±SD)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1FOXQ1-sh1成功沉默SW480细胞FOXQ1基因

Real-time PCR和Western blot 实验结果表明，第一条序列即FOXQ1-sh1沉默效果最佳。FOXQ1-sh1组与NC-shRNA组比较其mRNA水平下降了85.3%，蛋白质水平下降了75.7%，FOXQ1的mRNA和蛋白表达量在阴性组和对照组之间的差异没有统计学显著性，见图1。后续实验均以FOXQ1-sh1为沉默载体转染细胞，命名为FOXQ1-shRNA组。NC-shRNA组转染的细胞为阴性对照组，未转染细胞为正常对照(control)组。

2沉默FOXQ1基因对SW480细胞的血管形成能力的影响

FOXQ1-shRNA组管腔形成的数量明显少于NC-shRNA组(P<0.05)，同时FOXQ1-shRNA组大多没有形成的完整管腔，且直径明显小于对照组,见图2。

3沉默FOXQ1基因对SW480细胞存活率的影响

利用MTT、倍增时间及平板克隆来检测2组细胞存活率的差异。结果表明，2组细胞的存活率没有明显差别。FOXQ1-shRNA组与NC-shRNA组细胞发生倍增的时间、集落形成数及细胞的存活率均无明显差异,见图3。

4沉默FOXQ1基因对SW480细胞VEGF-A、MMP2和cyclin D1 mRNA和蛋白表达的影响

FOXQ1-shRNA组的VEGF-A、MMP2的相对表达量分别为NC-shRNA组的(33.8±1.4)%和(35.7±9.4)%(P<0.01)，cyclin D1表达无显著差异(P>0.05)，见图4。

5Shh通路可诱导SW480 细胞的FOXQ1表达

利用含重组Shh蛋白(10 μg/L)培养基培养SW480细胞，48 h后，检测细胞FOXQ1的表达变化，结果表明,重组蛋白Shh的处理能够明显增加SW480细胞FOXQ1的表达，见图5。

6FOXQ1介导了Shh诱导的细胞血管生成能力的改变

在NC-shRNA组中，Shh的诱导明显增强了细胞的血管形成，而在FOXQ1-shRNA组中Shh促血管形成能力程度有所减弱,见图6。

细胞存活率实验表明Shh的诱导明显增强了NC-shRNA组细胞的存活率，且与FOXQ1-shRNA组无明显差异，见图7。

在NC-shRNA组的细胞中，Shh诱导上调了MMP2、VEGF-A和cyclin D1的表达；在FOXQ1-shRNA组的细胞中，Shh诱导也可导致上述变化，但MMP2和VEGF-A的诱导程度均较NC-shRNA组细胞低，cyclin D1的诱导程度无明显差异，说明FOXQ1基因沉默可以部分逆转Shh所诱导的VEGF-A和MMP2的表达，见图8。

讨论

FOXQ1基因是叉头框基因家族的重要成员之一[3]。近年来，其作为原癌基因的角色逐渐被人们认识，与多种信号通路间的相互作用均与肿瘤密切相关[6-7]。国内外的研究表明在大肠癌组织中FOXQ1基因表达明显增高，并与肿瘤的分期及转移相关，已证实在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中，FOXQ1与肿瘤发生EMT关系密切，其异常表达可能导致E-cadherin的下调从而促进发生上皮间质转化，但其在结直肠癌的血管形成和生存率的作用及机制的研究，鲜有报道。

Figure 1.Silencing ofFOXQ1 expression in SW480 cells determined by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsFOXQ1-sh3;##P<0.01vscontrol group.

图1Real-time PCR和Western blot 检测FOXQ1基因干扰的效率

Figure 2.The images of angiogenesisinvitroassay. The number of tube formation of human umbilical vein endothelial cells in various groups were counted by fluorescence microscopy (×100).

图2体外血管形成实验

Figure 3.The proliferation ability of SW480 cells in different treatment groups. A: the effect ofFOXQ1 gene on the cell activity in each group was detected by MTT assay; B: after regular cultured for 7 d, the cell doubling time was calculated according to the formula; C: the images of the colony formation test in the 2 groups were showed. Mean±SD.n=3.

图3FOXQ1基因沉默对SW480细胞的生长能力、细胞倍增时间和平板克隆实验结果的比较

Kaneda等[6]的研究通过微阵分析，发现FOXQ1可通过上调WNT3A、RSPO2等基因从而调控结肠肿瘤的血管生成。我们的研究结果表明，FOXQ1可以通过对MMP2及VEGF-A的调控从调控的血管生成能力，这进一步阐明了其具体机制；Kaneda等[6]的研究还发现，在体外和体内实验中FOXQ1对增殖能力的影响呈相反表现，但在乳腺癌及胰腺癌等的研究中FOXQ1能促进增殖能力[15]，我们的研究中FOXQ1对cyclin D1促增殖基因无调控作用，致其对生存率无影响支持其体外实验的结论，这会不会与缺氧等微环境因素相关或者干细胞特性获取有关，值得进一步研究。

Shh信号通路转录因子包括Gli1、Gli2和Gli3。Chatel等[16]报道在Shh通路在大肠癌SW480细胞株并没有完整表达，主要是缺乏终末转录因子Gli1。然而大量的临床研究及细胞学实验都表明Shh的表达与大肠癌的关系密切[17]。仔细分析前人的研究，我们可以发现Gli2是Shh通路中除Gli1外的第二重要转录因子，基因组学研究表明它可以直接上调Gli1、CCND1、FOXA2、FOXC2、FOXP3等基因[17]，联系我们的结果，课题组认为正是Gli2调控FOXQ1的表达，而FOXQ1又可以发挥管理细胞恶性行为的作用，从而导致FOXQ1沉默可以部分逆转Shh通路所诱导的促血管生成作用，而之所以FOXQ1基因对Shh所诱导增殖无明显影响是因为FOXQ1基因自身对Cyclin D1等促增殖基因无调控作用。

Figure 4.The expression of VEGF-A, MMP2 and cyclin D1 at mRNA and protein levels in the cells with or without silencing of FOXQ1 was detected by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC-shRNA group.

图4Real-time PCR和Western blot检测VEGF-A、MMP2和cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平

Figure 5.After induced by recombinant Shh proteins for 48 h, the FOXQ1 expression at mRNA and protein levels in the SW480 cells was determined by real-time PCR and Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNc-shRNA group.

图5利用含重组蛋白Shh培养基培养NC-shRNA转染细胞48 h后检测FOXQ1基因的表达情况

本研究的结果进一步揭示了FOXQ1在大肠癌发生发展过程中的分子作用机理，这可能为寻找大肠癌生物治疗新的作用靶点提供理论依据，为大肠癌的靶向治疗提供新的思路。

Figure 6.FOXQ1 gene silencing partially reversed the angiogenic ability induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsShh+NC-shRNA group.

图6FOXQ1基因沉默可部分逆转Shh所诱导SW480细胞的促血管生成能力

Figure 7.FOXQ1 gene silencing had no obvious difference on proliferation ability induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.

图7FOXQ1基因沉默对Shh所诱导SW480细胞增殖能力的影响

Figure 8.FOXQ1 gene silencing partially reversed the expressions of VEGF-A and MMP2 at mRNA and protein levels in the cells induced by Shh protein induction. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsShh+NC-shRNA group.

图8FOXQ1基因沉默对3组细胞VEGF-A、MMP2和cyclin D1表达情况的影响

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

FOXQ1 gene mediate angiogenesis and proliferation induced by Shh in SW480 cells

ZHU Shuang-wei, LI Xiang-shu, PENG Xu-dong, CHEN Cheng, CHEN Xiao-long, WEI Zheng-qiang

(DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:384535713@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of FOXQ1 gene silencing on angiogenesis and proliferation ability of colon cancer cells induced by Sonic hedgehog (Shh). METHODS: Lentivirus expressing different FOXQ1-shRNA or negative cantrol (NC)-shRNA was used to infect the SW480 cells. The best silencing condition was screened and used in the following experiments. The SW480 cells were divided into interfered group (FOXQ1-shRNA) and control group (NC-shRNA). The MTT assay was used to observe the doubling time and cell activity. Tube formation assay was performed to detect the ability of angiogenesis. Meanwhile, the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF)-A, matrix metalloproteinase (MMP) 2 and cyclin D1 at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot. After induction of the cells by recombinant Shh proteins, the changes of angiogenesis and proliferation ability in each group were detected. At the same time, the transformation of related gene was examined. RESULTS: Compared with control group, the angiogenic ability in interfered group was decreased, and no obvious difference of proliferation ability was observed. The expression of VEGF-A and MMP2 was declined significantly, and the expression of cyclin D1 was not obviously changed. Recombinant Shh proteins improved the expression of FOXQ1 gene. Compared with NC-shRNA group, after induction, the angiogenic ability of FOXQ1-shRNA group was decreased, and the proliferation ability was not obviously changed. CONCLUSION: FOXQ1 gene mediates the angiogenic ability but does not affect the proliferation ability of SW480 cells. Meanwhile, it may be regulated by shh pathway.

[KEY WORDS]FOXQ1 gene; Sonic hedgehog; Colorectal cancer; Cell proliferation; Angiogenesis

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.014

[中图分类号]R730.23； R392-33； R735.3+4

[文献标志码]A

通讯作者△Tel: 023-89011172; E-mail：384535713@qq.com

[收稿日期]2015- 08- 21[修回日期] 2015- 12- 24

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0470- 07

杂志网址： http://www.cjpp.net