HPLC法测定复方葛根片中绿原酸的含量

2016-04-14杨文超路其康李允江毕云生张淑瑜于燕莉

实用医药杂志 2016年1期

关键词：绿原酸高效液相色谱法

杨文超，路其康，李允江，毕云生，张淑瑜，于燕莉

HPLC法测定复方葛根片中绿原酸的含量

杨文超，路其康，李允江，毕云生，张淑瑜，于燕莉＊

［关键词］高效液相色谱法；复方葛根片；绿原酸

［作者单位］250355山东济南，山东中医药大学药学院（杨文超，路其康，李允江）；250031山东济南，济南军区总医院药剂科（毕云生，张淑瑜，于燕莉）

复方葛根片是济南军区总医院制剂室生产的一种活血化瘀类中成药，制剂标准符合《中国人民解放军医疗机构制剂规范》（2002年增补版）。该中成药由葛根、丹参、茵陈和延胡索组成，具有活血化瘀，和气止痛，生津养心的作用，临床主要用于心脑血管等疾病的治疗［1］。方中茵陈清热利湿，利胆退黄，其含有的有效成分绿原酸具有抗菌、抗病毒，抗氧化、清除自由基，抗衰老，保护血管和降压的作用［2－4］。为更好地控制复方葛根片的临床疗效，笔者参考文献及2010版中国药典，采用HPLC法对复方葛根片中绿原酸含量进行测定，为完善该制剂的质量标准提供依据。

1　仪器与试药

1.1仪器Agilent1200高效液相色谱仪（安捷伦公司，四元泵，DAD检测器），Agilent1200色谱工作站（美国安捷伦公司）；UV－2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AS－3120型超声清洗器（北京华瑞博远科技发展有限公司）。

1.2试药复方葛根片（规格：0.4 g/片，济南军区总医院制剂室提供，批号：20150130；20150204；20150427），绿原酸标准品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号：110753－200413）。甲醇、乙腈为色谱纯，超纯水，试剂为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：SHIMADZU VP－ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈－0.05%－磷酸水溶液（10∶90）；检测波长：327 nm；柱温：30℃；流速：0.8 ml/min。

2.2溶液制备（1）对照品溶液。精密称取绿原酸对照品2.4 mg，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理30 min，冷却至室温，50%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成0.24 mg/ml的溶液，微孔滤膜滤过，作为对照品溶液。（2）供试品溶液。取复方葛根片刮去糖衣层，研为细末，精密称取3.048 g，置50 ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声（120 W，40 KHz）处理30 min，冷至室温，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液作为样品溶液。（3）阴性对照品溶液。取处方量的除茵陈外的其他药材，按复方葛根片制备工艺制成阴性对照样品，按照“2.2（2）”项下方法制成阴性对照品溶液。

2.3专属性试验分别精密吸取对照品、供试品、阴性对照品溶液注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件进行测定，记录HPLC图谱。结果阴性对照品溶液在绿原酸吸收峰相应保留时间无吸收峰，表明处方中其他成分对绿原酸含量测定无干扰，理论塔板数以绿原酸计>6000。结果见图1。

2.4线性关系精密量取“2.2”项下的对照品溶液1、1.5、2、2.5、3 ml分别置于10 ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，分别按“2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，以绿原酸质量浓度（mg/ml）为横坐标X，吸收峰面积积分值为纵坐标Y，进行线性回归，得方程为：Y＝4962X－38.2（r＝0.9996，n＝4），表明绿原酸在0.024～0.06 mg/ml范围内线性关系良好。

2.5精密度试验取同一绿原酸标准品溶液，在“2.1”项下色谱条件下连续进样6次，记录绿原酸吸收峰面积，计算RSD值为1.65%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.6稳定性试验取同一批复方葛根片（批号：20150204）的供试品溶液，在“2.1”项的色谱条件下分别于0、2、4、8、16、24 h进样，10 μl/次，记录绿原酸吸收峰面积，结果RSD＝1.58%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性试验取同一批复方葛根片（批号：20150204）的供试品溶液，按“2.1”项的色谱条件进行测定，平行进样5次，10 μl/次，记录绿原酸吸收峰面积，结果RSD＝0.65%（n＝5），表明重复性良好。

2.8加样回收率试验取已知绿原酸含量的同一批次复方葛根片（批号：20150204）精密称取6份，分别加入配制浓度为0.2532 mg/ml的标准品溶液1 ml，按照上述方法制备供试品溶液，并按照色谱条件测定绿原酸含量，计算加样回收率，结果见表1。

图1　HPLC图谱

表1　加样回收率试验结果（n＝6）

2.9样品含量测定取复方葛根片3批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，每个样品平行进样3次，记录峰面积，按外标法计算绿原酸含量，结果为：批号20130123样品平均含量为0.607 mg/g，批号20130216样品平均含量为0.618 mg/g，批号20130407样品平均含量为0.615 mg/g。

3　讨论

3.1检测波长及色谱条件的选择在测定绿原酸含量之前，用50%甲醇溶液配制0.01 mg/ml的绿原酸对照品溶液，用200～400 nm紫外光进行扫描，发现绿原酸在327 nm处有最大吸收。再对供试品溶液、阴性对照品溶液检验发现在327 nm处绿原酸峰型良好，且无其他成分干扰。同时参考相关文献［5－7］，确定本实验中绿原酸的检测波长327 nm。对乙腈－0.05%磷酸溶液（10∶90），乙腈－0.1%磷酸溶液（10∶90），乙腈－0.2%磷酸溶液（10∶90）三种流动相系统进行考察，结果发现以乙腈－0.05%磷酸溶液（10∶90）为流动相时分离效果最好。

3.2供试品溶液配制方法和提取工艺的选择考察了溶媒浓度及不同溶媒对绿原酸提取效率的影响，分别选择100%甲醇、50%甲醇和50%乙醇提取，结果显示在相同条件下50%的甲醇提取的绿原酸峰面积最大。供试品溶液的提取工艺考察了回流提取法和超声提取法，结果显示在相同条件下两者提取的绿原酸峰面积相差不大，考虑到方法简单、经济高效，提取工艺选择超声提取法。结果表明超声（120 W，40 KHz）处理30 min，样品溶液含量最高，且干扰成分较少，操作简便。

参考文献

［1］中国人民解放军总后勤部卫生部.中国人民解放军医疗机构制剂规范（2002年版）增补本［M］.北京：人民军医出版社，2007：21.

［2］刘颖，郭明晔，白根本.绿原酸的研究进展［J］.中药材，2012，35（7）：1180－1185.

［3］王丽萍，郭栋，王果，等.中药绿原酸的研究进展［J］.时珍国医国药，2011，22（4）：961－963.

［4］马援杰，江蔚新，李志雄，等.茵陈中绿原酸的提取工艺研究进展［J］.北京联合大学学报，2015，29（2）：57－60.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：223－224.

［6］卓菊，孙春燕.高效液相色谱法测定茵陈清肝颗粒中绿原酸的含量［J］.时珍国医国药，2005，16（6）：509－510.

［7］童珊珊，徐亚萍，金花，等.绵茵陈提取液中绿原酸的测定及其抗氧化活性研究［J］.江苏中医药，2009，41（4）：57－59.

［2015-07-18收稿，2015-08-16修回］

［本文编辑：刘一洋］

预防医学

［通讯作者］于燕莉，Email：yuyanli323@sohu.com