测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量

热萨莱提·伊敏+买买提·吐尔逊+塔伊尔·麦孜尼

【摘 要】 目的：建立采用超声波提取，高效液相色谱法测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量的方法。方法：色谱柱：安捷伦HC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相体积比50∶50的甲醇-0.4%磷酸溶液；检测波长为360nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min低压梯度洗脱。结果：绿原酸和芦丁分别在12.5～150μg/ml（r=0.9998）和12.5～150μg/ml（r=0.9998）浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为101.08% （RSD=1.38%，n=5）和99.56%（RSD=1.17%，n=5）。结论：该方法简便快速、重现性好、准确可靠，适用于新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量测定。

【关键词】 高效液相色谱法；二极管阵列检测器；新疆阔克阿木提果皮；绿原酸；芦丁

【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）18-0007-02

HPLC-PAD determination of Chlorogenic acid and Rutin contents in Xinjiang Kvk Amut peel

Resalat EMIN，Mamat TURSON，Tahir Mazin

Department of chemistry and environmental science，Kashigar Teachers College，Kashigar 844007，China

Abstract：Objective The content of Chlorogenic acid and Rutin contents in Xinjiang Kvk Amut peel was determined.Methods RP-HPLC with Agilent HC-C18 column（250mm×4.6mm.，5μm）.The mobile phase was CH3OH-0.4%H3PO4（50∶50，v/v） with flow rate of 1.0ml·min-1，the detection wavelength was 360nm.Results There was a linear correlation between the concentration of chlorogenic acid（12.5（150μg/mL，r=0.9998）and rutin（12.5 150μg/mL，r=0.9998）.The average recovery of chlorogenic acid and rutin were 101.08%（RSD=1.38%，n=5）and 99.56%（RSD=1.17%，n=5）.Conclusion The method is simple，rapid，reproducible，accurate and reliable，It could be used to identify and evaluate the quantitative determination of chlorogenic acid and rutin content of Xinjiang Kvk Amut peel.

Keywords：HPLC-PAD；Xinjiang Kvk Amut peel；Chlorogenic acid ； Rutin

新疆阔克阿木提，主要生长在南疆。果实扁圆形，熟时味酸、青色、有点淡淡的甜味，耐储运，堆积放一段时间后果实变黄、变软、变甜，酸味降低，口感变好。如放在温度较高的地方则会出现黑色斑点，颜色较差，因此比较适合低温储存。新疆阔克阿木提由于生长在日光照射强烈，照射时间长的地方，所以蛋白质、脂肪、糖、粗纤维、矿物质、维生素等物质比较丰富，尤其是含铁量很高，在维医中有不可替代的作用。新疆阔克阿木提具有提高免疫力、止咳润肺的功效，咳嗽痰稠或无痰、咽喉发痒干疼，慢性支气管炎、肺结核等患者可将新疆阔克阿木提埋在火炉里，等凉食用。目前新疆阔克阿木提果皮绿原酸和芦丁的提取和测定未见任何报道，本文研究了新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的不同提取方法，并利用高效液相色谱（HPLC）测定其含量。为新疆阔克阿木提资源的进一步开发研究利用药用价值的深入研究以及质量评价等提供可靠的参考依可靠的依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT高效液相色谱仪（配有SPD-M20A 二极管阵列检测器， DGU-20A5 在线脱气机，LC-solution 工作站）；KQ3200DE 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XA-1型多功能粉碎机（江苏姜堰市分析仪器厂）；ZK-82B 真空干燥箱（上海市实验仪器总厂）；赛多利斯 BS224S 型电子天平（德国）。

1.2 材料 绿原酸（批号：0753-200111）、芦丁（批号：0080-970）对照品由中国药品生物制品检定所提供；甲醇、乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯。新疆阔克阿木提采集于当地农村，将采集的新疆阔克阿木提用蒸馏水洗净，削皮阴干，药材粉碎机粉碎， 过60目筛，装试剂瓶备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：安捷伦HC-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.4% 磷酸（50∶50，v/v）；流速：1.0ml/min；检测波长：360nm；柱温：30℃；进样量：10μL 。

2.2 溶液的配制

2.2.1 标准溶液的制备 分别准确称取干燥至恒重的绿原酸及芦丁对照品各5.0mg于50ml容量瓶中，用甲醇完全溶解并定容至刻度，摇匀，得100μg/ml绿原酸和芦丁对照品标准溶液。分别准确吸取不同体积的绿原酸（12.5、25.0、50、100、150、200ml）及芦丁（12.5、25.0、50、100、150、200ml）标准液于6个10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，在冰箱里保存（7℃）。

2.2.2 样品溶液的制备 准确称取干燥并粉碎的新疆阔克阿木提粉果皮末2.0g （过60目筛），加75%甲醇（50ml），超声提取20min 浸泡1h超声20min，过滤除渣，50℃减压浓缩滤液，放至室温，用甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于冰箱备用。

2.3 检测波长的确定 从二极管阵列检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为360nm时色谱峰的峰形对称，达到定量分析要求，并根据相关文献[1-3]确定360nm作为检测波长。

2.4 方法线性关系考察 分别取对照品溶液12.5、25、50、100、150、200mg/μl，重复进样（n=6），按“2.1”下的色谱条件进行，记录峰面积。分别以对照品的浓度C（μg/ml） 为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，绿原酸的回归方程：A=5065.8c+6473.7，r=0.9998，线性范围为12.5～150μg/ml；芦丁的回归方程：A = 16432.8c-8250.8，r=0.9998，线性范围12.5～150μg/ml。

2.5 精密度试验和重复性试验 取混合对照品溶液，在“2.1”的色谱条件下连续进样5次进行检测，测定绿原酸和芦丁峰面积的RSD分别为1.55%和1.18%（n=5）。精密称取同一新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约2.0g，按“2.2”的方法制备样品溶液，计算所得到的样品（新疆阔克阿木提果皮）中绿原酸与芦丁含量的平均值分别为1.98%和0.43%，RSD分别为1.95%和1.83%。实验结果表明重现性良好。

2.6 稳定性试验 取同一样品溶液，分别放置0、3、6、9、12、15h后，在“2.1”的色谱条件下进样进行检测。通过计算所得到的绿原酸峰面积的RSD为1.76%和芦丁峰面积的RSD为1.99%。试验结果表明样品溶液在15h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 准确称取已知绿原酸、芦丁含量的新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约1g，分别添加不同量的绿原酸、芦丁标准溶液，按照“2.2”制备加标样品溶液，按“2.1”的色谱条件进行测定，测定结果见表1。其平均回收率为绿原酸101.08% 、芦丁99.56%；RSD分别为1.38%，1.17%。

2.8 样品含量测定结果 精密吸取少花龙葵样品溶液10μl进样，并按“2.1”的色谱条件进行平行5次测定，计算样品中绿原酸的含量。测定结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂及提取方法的选择 考察了75%甲醇回流法、75%甲醇超声波提取法、75%甲醇过夜浸泡法。结果表明，用75%甲醇超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min的方法，绿原酸和芦丁的提取率最高，而且超声提取具有操作简单、能耗低、易于实现，快速高效、不破坏有效成分的特点。故选择超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min作为提取时间。

3.2 流动相的选择 考察了不同比例的甲醇/乙酸，甲醇/0.1%磷酸，甲醇/0.4%磷酸，乙腈/磷酸，溶液为流动相时[4、5]，样品的分离情况，当体积比例为50∶50的甲醇/0.4%磷酸溶液作为流动相时，绿原酸、芦丁峰形良好能达到基线分离，并且与其他杂质峰得到了良好的分离，峰形良好。因此，确定甲醇-0.4%磷酸（50∶50，v/v）为流动相。

本实验建立了以75%甲醇为提取剂超声波提取，提取液经有机微孔滤膜（0.45μm）HPLC法同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁含量的定量分析方法。实验结果表明，绿原酸和芦丁分别在12.5～150 μg/ml（r=0.9998）和12.5～150μg/ml（r=0.9998）浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为101.08%（RSD=1.38%，n=5）和99.56%（RSD=1.17%，n=5）。该方法简便快速、重现性好、准确可靠、适用于同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量。为新疆阔克阿木提资源的深度开发利用，药用价值研究以及质量评价提供了可靠的参考依据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册[S].新疆：新疆科技卫生出版社，1999：175.

[2]张雪，褚文静，黄喜茹，等.反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参饮片中5种水溶性成分[J].理化检验-化学分册，2010，46（11）：1323-1325.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1081.

[4]郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中国实验方剂学杂志，2013（19）：75-78.

[5]张晓明，赵二劳，胡芳馨.反相高效液相色谱法测定玉米须中绿原酸和芦丁的含量[J].贵州农业科学，2013，41（6）：90-92.

（收稿日期：2014.07.04）

2.2.2 样品溶液的制备 准确称取干燥并粉碎的新疆阔克阿木提粉果皮末2.0g （过60目筛），加75%甲醇（50ml），超声提取20min 浸泡1h超声20min，过滤除渣，50℃减压浓缩滤液，放至室温，用甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于冰箱备用。

2.3 检测波长的确定 从二极管阵列检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为360nm时色谱峰的峰形对称，达到定量分析要求，并根据相关文献[1-3]确定360nm作为检测波长。

2.4 方法线性关系考察 分别取对照品溶液12.5、25、50、100、150、200mg/μl，重复进样（n=6），按“2.1”下的色谱条件进行，记录峰面积。分别以对照品的浓度C（μg/ml） 为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，绿原酸的回归方程：A=5065.8c+6473.7，r=0.9998，线性范围为12.5～150μg/ml；芦丁的回归方程：A = 16432.8c-8250.8，r=0.9998，线性范围12.5～150μg/ml。

2.5 精密度试验和重复性试验 取混合对照品溶液，在“2.1”的色谱条件下连续进样5次进行检测，测定绿原酸和芦丁峰面积的RSD分别为1.55%和1.18%（n=5）。精密称取同一新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约2.0g，按“2.2”的方法制备样品溶液，计算所得到的样品（新疆阔克阿木提果皮）中绿原酸与芦丁含量的平均值分别为1.98%和0.43%，RSD分别为1.95%和1.83%。实验结果表明重现性良好。

2.6 稳定性试验 取同一样品溶液，分别放置0、3、6、9、12、15h后，在“2.1”的色谱条件下进样进行检测。通过计算所得到的绿原酸峰面积的RSD为1.76%和芦丁峰面积的RSD为1.99%。试验结果表明样品溶液在15h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 准确称取已知绿原酸、芦丁含量的新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约1g，分别添加不同量的绿原酸、芦丁标准溶液，按照“2.2”制备加标样品溶液，按“2.1”的色谱条件进行测定，测定结果见表1。其平均回收率为绿原酸101.08% 、芦丁99.56%；RSD分别为1.38%，1.17%。

2.8 样品含量测定结果 精密吸取少花龙葵样品溶液10μl进样，并按“2.1”的色谱条件进行平行5次测定，计算样品中绿原酸的含量。测定结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂及提取方法的选择 考察了75%甲醇回流法、75%甲醇超声波提取法、75%甲醇过夜浸泡法。结果表明，用75%甲醇超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min的方法，绿原酸和芦丁的提取率最高，而且超声提取具有操作简单、能耗低、易于实现，快速高效、不破坏有效成分的特点。故选择超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min作为提取时间。

3.2 流动相的选择 考察了不同比例的甲醇/乙酸，甲醇/0.1%磷酸，甲醇/0.4%磷酸，乙腈/磷酸，溶液为流动相时[4、5]，样品的分离情况，当体积比例为50∶50的甲醇/0.4%磷酸溶液作为流动相时，绿原酸、芦丁峰形良好能达到基线分离，并且与其他杂质峰得到了良好的分离，峰形良好。因此，确定甲醇-0.4%磷酸（50∶50，v/v）为流动相。

本实验建立了以75%甲醇为提取剂超声波提取，提取液经有机微孔滤膜（0.45μm）HPLC法同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁含量的定量分析方法。实验结果表明，绿原酸和芦丁分别在12.5～150 μg/ml（r=0.9998）和12.5～150μg/ml（r=0.9998）浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为101.08%（RSD=1.38%，n=5）和99.56%（RSD=1.17%，n=5）。该方法简便快速、重现性好、准确可靠、适用于同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量。为新疆阔克阿木提资源的深度开发利用，药用价值研究以及质量评价提供了可靠的参考依据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册[S].新疆：新疆科技卫生出版社，1999：175.

[2]张雪，褚文静，黄喜茹，等.反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参饮片中5种水溶性成分[J].理化检验-化学分册，2010，46（11）：1323-1325.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1081.

[4]郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中国实验方剂学杂志，2013（19）：75-78.

[5]张晓明，赵二劳，胡芳馨.反相高效液相色谱法测定玉米须中绿原酸和芦丁的含量[J].贵州农业科学，2013，41（6）：90-92.

（收稿日期：2014.07.04）

2.2.2 样品溶液的制备 准确称取干燥并粉碎的新疆阔克阿木提粉果皮末2.0g （过60目筛），加75%甲醇（50ml），超声提取20min 浸泡1h超声20min，过滤除渣，50℃减压浓缩滤液，放至室温，用甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液置于冰箱备用。

2.3 检测波长的确定 从二极管阵列检测器采集的样品三维图谱中提取紫外光谱和不同波长的色谱进行对比，检测波长为360nm时色谱峰的峰形对称，达到定量分析要求，并根据相关文献[1-3]确定360nm作为检测波长。

2.4 方法线性关系考察 分别取对照品溶液12.5、25、50、100、150、200mg/μl，重复进样（n=6），按“2.1”下的色谱条件进行，记录峰面积。分别以对照品的浓度C（μg/ml） 为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，绿原酸的回归方程：A=5065.8c+6473.7，r=0.9998，线性范围为12.5～150μg/ml；芦丁的回归方程：A = 16432.8c-8250.8，r=0.9998，线性范围12.5～150μg/ml。

2.5 精密度试验和重复性试验 取混合对照品溶液，在“2.1”的色谱条件下连续进样5次进行检测，测定绿原酸和芦丁峰面积的RSD分别为1.55%和1.18%（n=5）。精密称取同一新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约2.0g，按“2.2”的方法制备样品溶液，计算所得到的样品（新疆阔克阿木提果皮）中绿原酸与芦丁含量的平均值分别为1.98%和0.43%，RSD分别为1.95%和1.83%。实验结果表明重现性良好。

2.6 稳定性试验 取同一样品溶液，分别放置0、3、6、9、12、15h后，在“2.1”的色谱条件下进样进行检测。通过计算所得到的绿原酸峰面积的RSD为1.76%和芦丁峰面积的RSD为1.99%。试验结果表明样品溶液在15h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 准确称取已知绿原酸、芦丁含量的新疆阔克阿木提果皮样品5份，每份约1g，分别添加不同量的绿原酸、芦丁标准溶液，按照“2.2”制备加标样品溶液，按“2.1”的色谱条件进行测定，测定结果见表1。其平均回收率为绿原酸101.08% 、芦丁99.56%；RSD分别为1.38%，1.17%。

2.8 样品含量测定结果 精密吸取少花龙葵样品溶液10μl进样，并按“2.1”的色谱条件进行平行5次测定，计算样品中绿原酸的含量。测定结果见表2。

3 讨论

3.1 提取溶剂及提取方法的选择 考察了75%甲醇回流法、75%甲醇超声波提取法、75%甲醇过夜浸泡法。结果表明，用75%甲醇超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min的方法，绿原酸和芦丁的提取率最高，而且超声提取具有操作简单、能耗低、易于实现，快速高效、不破坏有效成分的特点。故选择超声提取20min，浸泡1h，再超声提取20min作为提取时间。

3.2 流动相的选择 考察了不同比例的甲醇/乙酸，甲醇/0.1%磷酸，甲醇/0.4%磷酸，乙腈/磷酸，溶液为流动相时[4、5]，样品的分离情况，当体积比例为50∶50的甲醇/0.4%磷酸溶液作为流动相时，绿原酸、芦丁峰形良好能达到基线分离，并且与其他杂质峰得到了良好的分离，峰形良好。因此，确定甲醇-0.4%磷酸（50∶50，v/v）为流动相。

本实验建立了以75%甲醇为提取剂超声波提取，提取液经有机微孔滤膜（0.45μm）HPLC法同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁含量的定量分析方法。实验结果表明，绿原酸和芦丁分别在12.5～150 μg/ml（r=0.9998）和12.5～150μg/ml（r=0.9998）浓度范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为101.08%（RSD=1.38%，n=5）和99.56%（RSD=1.17%，n=5）。该方法简便快速、重现性好、准确可靠、适用于同时测定新疆阔克阿木提果皮中绿原酸和芦丁的含量。为新疆阔克阿木提资源的深度开发利用，药用价值研究以及质量评价提供了可靠的参考依据。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔分册[S].新疆：新疆科技卫生出版社，1999：175.

[2]张雪，褚文静，黄喜茹，等.反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参饮片中5种水溶性成分[J].理化检验-化学分册，2010，46（11）：1323-1325.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：1081.

[4]郭炬亮，李新霞，支玲.HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚[J].中国实验方剂学杂志，2013（19）：75-78.

[5]张晓明，赵二劳，胡芳馨.反相高效液相色谱法测定玉米须中绿原酸和芦丁的含量[J].贵州农业科学，2013，41（6）：90-92.

（收稿日期：2014.07.04）