急性白血病中联合检测USP22和BMI-1的表达及意义①

李冬云，田黎明，于广晴，张　纯，王为光

(佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154003)



急性白血病中联合检测USP22和BMI-1的表达及意义①

李冬云，田黎明，于广晴，张纯，王为光

(佳木斯大学附属第一医院， 黑龙江 佳木斯 154003)

摘要:目的：探讨急性白血病(AL)患者及健康成人中联合检测特异性泛素蛋白酶22(USP22)和B细胞特异性莫洛尼白血病病毒插入位点1基因(BMI-1)的表达及意义。方法：使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术半定量检测32例初治急性白血病患者及26例健康成人外周血中USP22及BMI-1的表达情况。结果：①USP22及BMI-1的表达水平在急性白血病初治组中显著高于对照组(P<0.05)；且两者之间呈显著正相关(r=0.748，P<0.01)。②USP22及BMI-1的表达水平在急性白血病初治组中显著高于完全缓解(CR)组患者(P<0.05)。③USP22及BMI-1在急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性髓细胞白血病(AML)中的表达水平无明显差异(P>0.05)。④在初治急性白血病患者中,USP22及BMI-1高表达组的患者CR率均低于其低表达组患者(P<0.05)。结论:AL患者中USP22及BMI-1的表达水平显著高于健康成人,两者的表达呈现一致性,且高表达的USP22及BMI-1患者其CR率低，因此检测该两者的表达水平对指导急性白血病患者的治疗及判断其预后具有重要意义。

关键词:急性白血病； USP22；BMI-1；RT-PCR

白血病(Leukemia)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发病率较以往发病更高[1]，在我国AL比慢性白血病(CL)发病率高。目前治疗白血病的方法包括联合化疗、造血干细胞移植、生物及基因治疗、中医中药等措施，但总体治疗效果欠佳。目前的主要任务是研究白血病的发病机理及可能影响其发生发展的生物学标志基因来评价其预后及治疗效果，寻找这一过程中任意环节的关键因素，已成为许多学者研究白血病的新方向，进而研究靶点药物用于白血病的治疗[2]。特异性泛素蛋白酶22属于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)家族中的一种泛素特异肽酶，其实现广泛的生物学功能主要依靠对底物靶分子的去泛素化[3]。USP22对细胞周期发挥重要的调控作用，此外，USP22还能和人类染色质重塑复合体SAGA(h-SAGA )的亚单位相互作用，使h-SAGA 表现出激活状态，从而激活目标基因的转录，这一结果是依靠USP22 N末端的锌指结构和C末端的泛素水解酶活性区联合完成。BMI-1属于多梳基因家族(Polycomb group，PcG)的一个原癌基因[4]，能对造血干细胞及白血病干细胞的分化、更新等起到重要作用，能直接参与细胞的繁殖与生长，BMI-1在体内表达异常时则会诱发多种肿瘤的发生。本次实验，我们意在通过对USP22与BMI-1这两个指标在初治白血病患者治疗前后与正常健康成人外周血中的检测，探讨两者在急性白血病中的意义。

1资料与方法

1.1病例来源

32例初治AL患者均来源于佳木斯大学附属第一医院血液科自2014-03~2015-06住院患者,男18例,女14例, 年龄18~74岁,中位年龄48岁，其中ALL 10例，AML 22例；AL患者均行一个标准化疗程疗后，依据骨髓细胞学分析统计出达完全缓解的患者。26例健康对照组来自同时期健康体检人群，女11例，男15例，年龄18~70岁，中位年龄42岁。参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[5]来评价所有患者的诊断及治疗效果。

1.2单个核细胞分离和总RNA提取及鉴定

取外周血4mL后肝素抗凝，缓慢加入4mL淋巴细胞分离液，以3000r/min离心12 min,分离出单个的核细胞,采用UNIQ-10柱式Trizol法提取总的RNA，使用紫外分光光度计检测RNA的质量及纯度。

1.3RT-PCR分析

1.3.1USP22mRNA引物：上游引物5'-GGGAGGAGGCTCACCTCTAA-3'，下游引物为5'-AAAACCATCAACTCGGGCCT-3',产物长度113bp；BM-I1引物：上游引物为:5'-TGGAGAAGAAATGGTCCACTTC-3'；下游引物为: 5'-GTGAGGAAACTGTGGATGAGGA-3'；扩增片段222bp。内参GAPDH引物:上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3',下游引物: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3',扩增片段长度226bp。

1.3.2按照RT-PCR试剂盒说明，采用一步法RT-PCR对目的基因USP22及BMI-1和内参基因GAPDH进行扩增。根据以下程序扩增：94℃预变性5min；94℃ 45秒，59℃ 30秒，72℃ 60秒,PCR扩增40个循环，72℃延伸5min。

1.3.3PCR产物电泳：取8μL的扩增产物上样于2.0%琼脂糖凝胶中120V电泳25min，紫外投射仪观察结果，分别以USP22mRNA、BMI-1mRNA、内参GAPDH mRNA电泳带的灰度比值作为结果。

1.4统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析，分别应用独立样本t检验、Spearman 等级相关分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1USP22及BMI-1在AL和正常对照组的表达

见表1，两者呈显著正相关(r=0.748，P<0.05)，见图1。

表1　USP22及BMI-1在AL和正常对照组的表达

注：*P<0.05,和正常对照组相比。

图1　USP22及BMI-1的相关性

2.2USP22及BMI-1在AML组和ALL组中的表达

USP22在AML组表达水平为0.412±0.070，在ALL组表达水平为0.436±0.142，两者无统计学差异(P>0.05)；BMI-1在AML组表达水平为0.547±0.125，在ALL组表达水平为0.618±0.120，两者无统计学差异(P>0.05)，见表2。

表2　USP22及BMI-1在AML组和ALL组中的表达±s)

注：#P>0.05，和ALL组比较。

2.3AL患者化疗后USP22及BMI-1表达水平与完全缓解率的关系

3讨论

G. V. Glinsky 等人利用微集阵列技术, 对不同来源组织的肿瘤细胞进行大量分析, 归纳出在多数细胞中普遍高表达的11个标记基因(即癌死亡基因标签)，USP22及BMI-1 即为其中的两个标签基因。USP22作为肿瘤干细胞基因已被发现，其可通过增强Myc介导的基因转录促进细胞恶变及肿瘤生长,USP22表达降低能使Myc高表达细胞停滞在G1期，减低克隆形成率[6]。 USP22 已被证实在多种肿瘤中高表达，如结前列腺癌、直肠癌、肺癌等，这些研究证实USP22作为原癌基因在癌细胞侵袭和转移过程中扮演重要角色。大量相关文献报道，BMI-1在造血系统恶性肿瘤及实体肿瘤中高表达，并且与肿瘤转移潜能、侵袭、预后、患者耐药密切相关，其表达水平随造血细胞的分化而下降，当BMI-1水平异常增高时大量的幼稚细胞无限增殖积累，导致白血病的发生，这表明BMI-1癌基因能激活人类肿瘤中的肿瘤干细胞，从而表现出强烈的肿瘤转移性和化疗耐药性。 目前很多实验证实BMI-1和 USP22在功能上存在交叉重叠：两者功能均参与水解组蛋白H2B上的泛素；敲除基因表达均导致细胞停滞在G1期；USP22通过BMI-1调控的通路实现细胞恶性行为[7]。因此，本次实验从上述论述出发，采用RT-PCR研究急性白血病患者及健康成人外周血中USP22和BMI-1在急性白血病中的表达及意义，研究结果表明，AL初治患者USP22和BMI-1的表达明显高于健康成人，且两者呈正相关关系；根据急性白血病初治患者中USP22和BMI-1的表达水平，将其高于平均水平为高表达组、低于平均水平为低表达组，发现USP22和BMI-1的高表达组经化疗后的CR率低于其低表达组，说明USP22和/或BMI-1高表达患者不易获得CR。

综上所述，USP22及BMI-1在急性白血病中关系密切，二者的活化可能会促进急性白血病的发生发展、加速急性白血病的进程、影响治疗预后等，因此联合检测BMI-1和USP22可能有助于患者分层、判断患者预后、指导个体化治疗有一定的意义。

参考文献：

[1]段翠翠，王庆国，王为光，等.急性白血病病人XIAP和Caspase-3的表达及其临床意义[J].黑龙江医药科学,2014,37(2):83-84

[2]田黎明，郝翠翠，代建华，等.SIRT1，Ku70在急性白血病中的表达及意义[J].黑龙江医药科学,2011,34(2):3-5

[3]徐志阳，田文亮，付雪，等.特异性泛素蛋白酶22在急性白血病细胞中的表达及其临床意义[J].肿瘤防治研究，2014，41(4)：366-369

[4]Kim SH, Singh SV. The role of polycomb group protein BMI-1 and Notch4 in breast cancer stem cell inhibition by benzyl is othiocyanate [J]. Breast Cancer Res Treat，2015，149 (3): 681-692

[5]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].北京:科学出版社,2009:103-134

[6]Kobayashi T, Iwamoto Y，Takashima K，et al. Deubiquitinating enzymes regulate Hes1 stability and neuronal differentiation [J]. FEBS J，2015，282(13):2475-2487

[7]Yan-Long Liu，Shi-Xiong Jiang，Yan-Mei Yang，et al. USP22 Act as an oncogene by the Activation of BMI-1 Mediated INK4a/ARF Pathway and Akt Pathway[J].Cell Biochem Biophys,2012,62(1):229-235

(收稿日期：2015-05-24)

中图分类号：R733.7

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2016)01-0080-02

作者简介:李冬云(1989～)女，湖南邵阳人，在读硕士研究生。通讯作者:田黎明(1962～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，教授，硕士研究生导师。E-mail：TLM3388@163.com。