缺血性卒中后神经元的泛素化调控

孙艺航，罗宁，葛金文

(湖南中医药大学中西医结合学院，长沙 410208)

在不同病理条件下生物体会发生一系列改变，细胞通过感知外界变化整合、传输信息并做出相应调整，这种动态变化由多种复杂机制(包括翻译后蛋白质修饰)共同参与，可动态的规划蛋白的特性和功能，以应对细胞稳态失衡[1]。翻译后蛋白质修饰的种类较多，包括小的化学基团修饰(如氨基酸侧链磷酸化、乙酰化或甲基化)和小蛋白质修饰，其中对泛素激活的研究最广泛，泛素激活通过3种酶的级联反应与靶蛋白共价结合影响蛋白质的稳定、定位和相互作用[2-3]。泛素化对细胞稳态的影响至关重要，据估计，细胞中任何时间的蛋白质泛素化均超过5 000种，约占已编码人类蛋白质组的25%[4]；此外，泛素化还参与了多种细胞程序，包括细胞周期控制、免疫反应、炎症以及凋亡[5]。

缺血性卒中后，缺血区及其周围未坏死区域的神经元会立即发生泛素化反应，并可在其中检测到泛素蛋白结合物，研究表明，泛素化蛋白结合物水平的增加在神经保护中发挥了重要作用[6]。但目前缺血性卒中后蛋白泛素化升高与神经元损伤之间的关系仍不清楚。现对泛素化的调控过程、神经元内泛素化修饰以及缺血性卒中后泛素化与神经元的潜在联系予以综述。

1 泛素化的调控过程

1.1泛素标记底物蛋白 几乎所有泛素与底物蛋白结合都需要泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的连续作用。目前只鉴定出泛素活化酶1和泛素活化酶6两种哺乳动物泛素活化酶，它们可特异性地激活人体内泛素[7]；泛素活化酶E1的作用呈ATP依赖性，泛素活化酶E1催化泛素C端甘氨酸残基发生腺苷化，随后将其转移到泛素活化酶E1活性中心的半胱氨酸结构域，并形成硫酯键[8]。有报道，已鉴定出哺乳动物细胞中超过30种泛素结合酶E2[9]，当泛素结合酶E2与泛素活化酶E1反应后，泛素结合酶E2的半胱氨酸结构域攻击泛素活化酶E1与泛素间的硫酯键，使其形成新的泛素结合酶E2与泛素间的硫酯键[10]。此时，泛素连接酶E3与底物蛋白连接，并作为支架协助泛素结合酶E2与泛素间硫酯键接近底物，从而使泛素与底物形成蛋白共价结合。目前对泛素连接酶E3的研究较广泛，已发现超过600多种泛素连接酶E3，其与泛素结合酶E2以约25 000种方式配对，以保证泛素与底物蛋白的识别具有特异性[7]。

1.2泛素修饰底物蛋白 泛素修饰底物蛋白的方式很多，如单泛素化、多位点单泛素化、形成泛素链。泛素包含1个N端甲硫氨酸残基(M1)和7个内部的赖氨酸残基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)[5]。根据不同连接方式，可将泛素链分为同源多聚泛素链和异源多聚泛素链；同源多聚泛素链的形成是泛素分子内部的赖氨酸残基依次相互连接；而异源多聚泛素链中包含超过两种及以上的连接方式[4]。

随着蛋白质组学的发展，发现多聚泛素链还可以被甲基化、泛素样物质、磷酸化等修饰[11]。不同泛素结合域可以多样的泛素修饰方式与目标蛋白结合，进而在细胞内发挥不同调控作用，可见泛素链的功能与其结构息息相关[2]。K48链是目前研究最广泛的泛素链，占泛素修饰50%，始终被蛋白酶体识别并作为降解信号[7]；K63链和M1链主要构建和拆卸信号复合物，参与信号免疫和核因子κB通路的信号转导；而单泛素化和多位点单泛素化是完全不同的修饰方式[12]。由此可见，区分不同泛素链连接的泛素连接酶E3对于判断其参与的下游通路及其介导的反应至关重要。

1.3泛素化蛋白的降解和去泛素化 泛素-蛋白酶体系统可以清除错误折叠和损伤的蛋白，目前预测超过50%被标记的泛素化蛋白通过蛋白酶体途径被降解。26S蛋白酶体由一个具有蛋白水解功能的20S核心颗粒组成，呈筒状结构，是负责细胞内降解的超大分子机器[11]。20S颗粒的一端或两端包裹19S/PA700调节激活复合物，对进入20S核心颗粒的通路进行特异性调控，该复合物通过与泛素链结合，发生去泛素化、去折叠成线性多肽链后，进入20S核心颗粒，因此蛋白酶体对泛素化蛋白的降解具有特异性[7，13]。

泛素化是一种可逆性修饰，去泛素化是泛素化的逆过程，由去泛素酶完成。去泛素酶通过水解泛素C端与底物蛋白之间的酯键、肽键或异肽键，防止泛素进入蛋白酶体而被降解，维持游离泛素的水平[14]。泛素酶种类繁多，目前人类基因组编码发现了100多种去泛素酶，它们参与调控神经退行性疾病、免疫、炎症和肿瘤等疾病的发生与进展[4]。根据酶的活性中心将泛素酶分为泛素特异性蛋白酶家族、泛素C端水解酶家族、 Machado-Josephin结构域蛋白酶家族、卵巢肿瘤相关蛋白酶家族和MPN(+)/JAMM蛋白酶家族五大类，前四类被统称为半胱氨酸蛋白酶，MPN(+)/JAMM蛋白酶家族属于金属蛋白酶[7]。泛素化和去泛素化相互协调，在维持细胞内泛素水平、信号传递以及精确调控蛋白质泛素化类型和程度过程中发挥了重要作用。

2 缺血性卒中后的泛素化修饰

2.1泛素化修饰在神经元内的作用 泛素化修饰对于神经元的发育过程非常重要。首先，神经元细胞体生成泛素后，转运至轴突和树突等远处突起，但运输速度非常缓慢，在不同神经中可能需要数天甚至数周；而氧化应激反应伴随泛素升高的运输速度缓慢可能使远端轴突和树突易受到缺血性卒中后氧化应激反应的影响[15]。神经元中泛素活化酶E1或蛋白酶体亚基的功能缺失等突变会阻碍轴突修剪，提示泛素化修饰可能对某些轴突修剪的发育过程中起作用[16]。其次，神经元活动的增加和减少与树突棘中泛素化蛋白的数量有关，许多参与突触功能的关键分子受泛素化调控，包括许多突触后密度的结构成分和受体[17-18]。蛋白酶体途径是神经元清除异常蛋白的主要机制之一，如果蛋白酶体途径不能持续有效的发挥作用，神经元内毒性的积累可能会威胁神经元的生存[19-20]。

泛素可作为神经元内游离单体结合底物而被降解，虽然去泛素酶可以使泛素循环使用，但体内泛素仍被蛋白酶体持续破坏。泛素C端水解酶L1(ubiquitin C-terminal hydrolase L1，UCHL1)在神经元内高度表达，与泛素的亲和力很高，对维持神经元内的泛素水平起重要作用[21]。研究表明，UCHL1基因突变小鼠的神经元结构和形态发生改变，且泛素水平降低，提示UCHL1可防止泛素降解[22]，但具体机制尚不明确。

泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一种与蛋白酶体动态结合的去泛素酶，剪切蛋白质底物上的泛素链，避免了被蛋白酶体识别降解而稳定泛素水平，属于泛素特异性蛋白酶家族[23]。USP14的功能受到蛋白酶体的严格调控，USP14与蛋白酶体结合会刺激USP14的泛素水解酶活性[24]。研究证实，通过控制USP14与蛋白酶体的结合，细胞能将USP14的作用限制在与蛋白酶体结合的底物上；USP14的缺失导致蛋白酶体对泛素化蛋白的作用增强[25]。USP14对于神经元内的泛素稳定同样重要，对共济失调小鼠模型的研究发现，USP14缺乏小鼠表现出神经肌肉连接处的突触发育和功能障碍以及神经末梢肿胀[26]。

2.2缺血性卒中后的泛素化及蛋白酶体改变 缺血性卒中可诱导不同类型的泛素修饰，目前，K6、K11、K48和K63泛素链均在全脑缺血中被发现[27]；K48和K63链在局灶性脑缺血后被发现[28]，可见，不同泛素链对于区分不同下游通路介导的底物蛋白十分重要。

缺血性卒中对相应脑区细胞的影响较大，再灌注损伤也是引起泛素聚集的关键因素之一[29-30]。研究发现，大鼠脑海马区局灶性脑缺血后的泛素免疫活性升高，出现大量泛素蛋白结合物[26]；电镜下，短暂性脑缺血引起海马神经元的泛素严重聚集，脑缺血4 h后神经元内泛素聚集，并在缺血再灌注24 h和48 h的神经元内出现泛素逐渐积累；再灌注4 h时，泛素聚集部位主要集中在胞体、树突和核膜的胞内小泡；再灌注24 h时，神经元的线粒体、高尔基体和树突质膜也出现了泛素聚集[31]。因此，缺血后的海马神经元胞体和胞突都受到应激后的级联反应损伤，故神经元被认为是缺血后泛素化增加的主要场所[32]。此外，缺血性卒中后还可降低蛋白酶体活性，对实验性脑缺血模型的研究显示，脑缺血后最初数小时内的广泛蛋白酶体抑制具有神经保护作用；但是缺血后期蛋白酶体的活性下降，不能及时清除被泛素标记的蛋白，故引起泛素化蛋白的沉积，进而导致神经元内泛素结合物水平升高，游离泛素减少，提示可能存在泛素功能障碍和继发于缺血性损伤蛋白的错误折叠[33-34]。

2.3泛素连接酶E3介导的缺血性卒中后神经元保护 一些特定的泛素连接酶活性和水平的增加与脑缺血后的神经保护有关。热激蛋白70羧基端反应蛋白作为具有泛素连接酶活性的蛋白质，在脑内高表达，是蛋白质稳定机制的主要组成部分，通过热激蛋白70羧基端反应蛋白在C端U-box功能域的泛素连接酶活性防止氧葡萄糖剥夺诱导的大鼠全脑缺血后海马脑片和体内过表达的神经元死亡；而热激蛋白70羧基端反应蛋白过表达可阻止神经元死亡，阻断激活蛋白激酶B和真核细胞起始因子-2α的磷酸化，并阻止脑缺血及再灌注后泛素化蛋白比例的降低[35-37]。

神经前体细胞发育下调蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，Nedd4)蛋白家族属于E3泛素连接酶，包括Nedd4-1/2、Itch等；Nedd4家族相互作用蛋白1(Nedd4 family-interacting protein 1，Ndfip1)是Nedd4家族E3的衔接蛋白，可与Nedd4蛋白家族特异性结合，参与泛素化过程[38-39]。研究显示，大脑中动脉短暂缺血后，皮质中Nedd4-2、Itch和Ndfip1显著上调；而在存活的皮质神经元中，只有Nedd4-2与Ndfip1上调，而非Nedd4-1或Itch，提示Nedd4家族蛋白对缺血的调节呈特异性和差异性。Ndfip1和Nedd4-2在大脑缺血后皮质区存活神经元中的共定位和相互作用表明，Ndfip1可能通过促进Nedd4-2介导的泛素化降解毒性蛋白，从而改善皮质神经元的存活[40]。Ndfip1敲除小鼠单侧脑缺血后的梗死面积更大，提示Ndfip1对脑缺血后神经元具有保护作用[41]。

帕金蛋白在体内广泛表达，在神经元中发挥着多种作用，它的基因突变和缺失是帕金森病最常见的原因，帕金蛋白的N端为类泛素结构区，具有E3泛素连接酶活性[42]。动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是帕金蛋白的底物蛋白，主要作用于线粒体的分离，同时可以控制神经前体细胞的迁移和神经元分化[43-44]。线粒体功能障碍是造成缺血性卒中神经元损伤以及缺血再灌注损伤的主要原因之一。研究表明，对小鼠神经母细胞瘤细胞进行氧葡萄糖剥夺以及氧葡萄糖剥夺再灌注损伤后，出现线粒体断裂，Drp1蛋白表达增加，帕金蛋白表达降低，提示帕金蛋白通过泛素化介导的Drp1缺失对氧葡萄糖剥夺诱导的神经元线粒体损伤和凋亡具有保护作用[45-46]。

线粒体E3泛素连接酶1(mitochondrial E3 ubiquitin ligase 1，Mul1)是一种多功能线粒体膜蛋白，它的泛素连接酶结构域可以泛素化多种信号分子，如Drp1和线粒体融合蛋白2、激活蛋白激酶B等[47]；在脑缺血大鼠模型中，Mul1上调；而抑制Mul1表达后，大鼠大脑梗死面积明显减少，且Drp1和线粒体融合蛋白2的泛素化受到抑制。可见，Mul1通过恢复线粒体功能达到了保护神经元的作用[30]。综上所述，缺血后泛素水平的升高可能由泛素结合机制成分的上调引起，而泛素结合机制的识别至今仍未知。

2.4缺血性卒中后小类泛素修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier protein，SUMO)介导泛素化修饰 SUMO属于泛素样蛋白家族成员，拥有与泛素类似的空间三维分子结构域，在泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3的连续作用下，通过C端甘氨酸残基结合底物蛋白，参与蛋白质的翻译后修饰[48]。与泛素过程不同，SUMO不直接作用于蛋白质降解，通常通过加强蛋白质结构稳定性保护目标蛋白[49]。目前，人体内已发现的SUMO有SUMO-1、SUMO-2、SUMO-3、SUMO-4，SUMO2和SUMO3的N端三个氨基酸不同，但功能无差异，故被认为是相同的物质，称为SUMO2/3；而SUMO1和SUMO2/3有50%的相同之处[50]。受到缺血、低氧、氧化应激等刺激诱导后，SUMO2/3结合蛋白的能力显著升高[27]。大鼠脑缺血后6 h和24 h，皮质和海马梗死区的SUMO-2/3表达增加，而抑制SUMO-2/3表达后，类缺血等条件下的神经元耐受力在短时间内降低，提示短暂脑缺血后会激活SUMO-2/3结合蛋白的能力，故认为SUMO是一种内源性神经保护途径的关键因子，SUMO-2/3是一类作用肯定的神经元保护性小分子蛋白物质[51-52]。

缺血性卒中后的SUMO与泛素亦相关，SUMO与泛素会在缺血后大脑的同一区域同时出现，且泛素存在于SUMO2/3免疫沉淀物中；抑制泛素蛋白酶体可导致SUMO2/3结合物积累；SUMO本身可以泛素化，SUMO的E3连接酶可以调节泛素的结合水平，SUMO和泛素可以竞争相同的赖氨酸残基[53]。体外实验证明，在氧葡萄糖剥夺细胞内，SUMO-2/3是诱导蛋白泛素化的必需分子，提示缺血性卒中后SUMO是对泛素保护作用的延伸；泛素和SUMO可能协同作用，保护神经元免受缺血损伤[54]。

3 小 结

泛素化可调控神经元的生长发育和功能活动，缺血性卒中后的缺血损伤及蛋白酶体功能的抑制与神经元内泛素水平的升高相关，部分泛素连接酶E3对脑缺血后神经元起保护作用。泛素的复杂性限制了人们对其他去泛素酶和泛素连接酶E3在缺血性卒中中作用的认识，对于缺血性卒中与泛素关联靶蛋白数量的了解有助于对泛素化的进一步探索。由于SUMO对缺血性卒中的神经元和泛素具有保护作用，因此，诱导SUMO表达可能成为缺血后神经元存活的药物靶点。虽然目前已有针对泛素连接酶E3的靶向药物，但由于缺乏泛素和缺血性卒中关系的直接证据，导致无法预测药物干预的走向，因此需要对泛素与缺血的相互联系进行深入研究。