PCR过程中生成引物二聚体回收再利用的研究

陈琪，刘晓峰

(江西省九江市第一人民医院，九江 332000)

在聚合酶链式反应 （Polymerase Chain Reaction，PCR）过程中，引物的 3’端不依赖模版相互作用生成大量非特异性产物，尤其是引物二聚体[1]。有研究报道，在两引物的3’端只要有一个碱基互补配对，30个循环即可生成引物二聚体[2]。许多实验通过引物的优化设计、控制反应条件、热启动和酶的优化等方法来减少引物二聚体的生成[3，4]，但引物浓度较高时，这些方法不能减少引物二聚体的生成。因此，引物二聚体被认为是PCR反应过程中的必然产物，严重干扰实时荧光定量PCR、反转录酶-聚合酶链式反应 （reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）等实验结果[5-7]。然而引物二聚体是否具有一定的功能，纵观国内外文献却鲜有报道。本实验组利用粉尘螨1类变应原基因的重组质粒pET28a(+)-ProDer f 1为模版，以ProDer f 1特异性引物形成的二聚体为引物进行PCR扩增，成功扩增出ProDer f 1基因，验证了回收的引物二聚体依然具有特异性引物的功能，现将详细结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和引物 含有粉尘螨1类变应原基因的重组质粒pET28a(+)-ProDer f 1和大肠埃希菌 （Escherichia colin，E.coli）DH5α 感受态细胞本实验室自制并保持；根据GenBank公布的ProDer f 1（AB034946.1）基因序列设计特异性引物，ProDer f 1-F：TATGGATCCCGTCCAGCTTCAAT CAAAACT，ProDer f 1-R：GGCCTCGAGTCACATG ATTACAACATATGG，理论扩增出目的基因为912bp。

1.1.2 主要试剂和仪器 SK2072即用PCR扩增试剂盒 （Taq）、SanPrep柱式 DNA胶回收试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、250bp DNA Marker(SM0311)、50bp DNA Marker(BSM0371)均购自生工生物工程 （上海）有限公司；ABI2720型PCR仪、Beckman高速冷冻离心机、Bio-Rad水平电泳仪、SYNGENETM凝胶电泳成像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 引物二聚体的生成与回收 生成引物二聚体PCR 体 系 （27μl）：10 ×PCR Buffer 2.5μl，MgCl2（25mmol/L）2μl，dNTPs （2mmol/L）2.5μl，ProDer f 1正、 反向引物各 0.5μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，ddH2O 18.5μl，蘸取含有 pET28a(+)-ProDer f 1的阳性菌落吹打混匀。反应条件：94℃ 5min，94℃30sec、55℃ 30sec、72℃ 30sec，35 个 循 环 ，72℃10min。PCR产物行 1%琼脂糖凝胶电泳（90V，50min）并拍照。按SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书切胶回收引物二聚体。

1.2.2 以回收的二聚体为引物的PCR PCR体系（40μl）：10×PCR Buffer 5μl，MgCl2（25mmol/L）2μl，dNTPs （2mmol/L）2.5μl， 回收的引物二聚体 10μl，Taq DNA 聚合酶（5U/μl）0.5μl，ddH2O 20μl，蘸取含有pET28a(+)-ProDer f 1的阳性菌落吹打混匀。反应条件：94℃ 5min，94℃ 30sec、55℃ 30sec、72℃30sec，35个循环，72℃ 10min。同样反应体系条件下以DH5α阴性菌为模板和未加引物二聚体的阳性菌做模板的PCR产物为阴性对照。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳 （90V，50min）并拍照。按SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物。

1.2.3 PCR产物的序列比对 ProDer f 1特异性引物PCR产物和二聚体为引物的PCR产物纯化后进行测序（由生工生物工程有限公司完成），并用DNAMAN软件进行序列比对分析。

2 结果

2.1 引物二聚体的生成与回收 ProDer f 1特异性引物的菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的基因在1000bp左右出现特意条带，同时生成的引物二聚体（Primer Dimer，PD）也出现模糊条带（图1A）。切胶回收引物二聚体，回收产物在50bp～200bp之间出现模糊条带（图1B）。

2.2 以二聚体为引物的PCR 以二聚体为引物的菌落 （阳性）PCR产物和以ProDer f 1特异性引物的菌落PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，两者在相同位置出现特意条带，且和ProDer f 1基因一致；而以二聚体为引物的阴性菌落PCR未出现特异条带（图 2）。

图1 A：ProDer f 1特异性引物的菌落PCR过程中生成的引物二聚体

图2 1：ProDer f 1 基因，2：ProDer f 1特异性引物的阳性菌落PCR产物，3：以二聚体为引物的阳性菌落PCR 产物，4：ProDer f 1特异性引物阴性菌落PCR产物，5：以二聚体为引物的阴性菌落PCR产物

2.3 序列比对ProDer f 1特异性引物PCR产物和二聚体为引物的PCR产物的序列经DNAMAN软件比对，同源性达98.68%，两者同ProDer f 1基因比对，同源性达99.56%，但以二聚体为引物的PCR产物序列3’端的CGT和5’端的CAT 3个碱基缺失，具体原因有待进一步研究。

3 讨论

螨性变应原是引起哮喘等过敏性疾病的主要变应原[8-10]，螨性变应原基因一直以来是研究的热点[11，12]，而特异性引物是变应原基因扩增和鉴定的重要试剂，引物二聚体的生成不仅严重影响实验的结果，也是对实验试剂的浪费。本实验利用回收的二聚体为引物，对目的基因进行PCR扩增，成功扩增出目的基因，并通过序列比对证明其PCR产物与特异性引物的PCR产物同源性高达98.68%。分析其原因可能为：⑴引物二聚体是PCR过程中形成的非特异性产物，大小不一（多为50-250bp），其中可能含有特异性引物的序列片段；⑵引物二聚体解链温度要低于目的基因[13]，部分二聚体解链后发挥引物作用。同时我们也看到，以二聚体为引物PCR产物的条带较特异性引物PCR产物的条带暗，且较倾向于生成较多的引物二聚体；由此推论，引物二聚体可能具有正反馈作用，以链式效应促进更多二聚体的生成。

引物二聚体的形成干扰实验结果的报道很多，但其也具有一定的功能效应。吴崇军[14]等利用引物二聚体形成的原理，建立了一种新的克隆目的基因的方法；本实验以回收的二聚体为引物，PCR扩增出目的基因，且和特异性引物的PCR产物具有高度的同源性，证明其具有引物功能。因此，我们可以认为，引物二聚体既可以作为目的基因扩增的模版，同时还具有特异性引物的功能。