非小细胞肺癌组织中ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ的表达及意义

罗　静　徐美青　郭明发　魏大中　柳常青　孙翔翔

(浙江医院胸外科，浙江　杭州　310013)



非小细胞肺癌组织中ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ的表达及意义

罗静徐美青郭明发魏大中柳常青孙翔翔

(浙江医院胸外科，浙江杭州310013)

〔摘要〕目的检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织中核切除修复交叉互补基因(ERCC)1、糖核苷酸还原酶(RR)M1、β-微管蛋白(β-tubulin)Ⅲ表达水平及其临床意义。方法采用免疫组化法(SP二步法)对80例NSCLC患者肿瘤组织进行ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ检测，分析患者的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表达与临床特征及预后的关系。结果80例NSCLC肿瘤组织中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ，蛋白表达阳性率分别为55.0%、42.5%和52.5%。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表达阳性率与患者的性别、年龄、组织学类型、临床分期、淋巴结转移均无明显相关性(P>0.05)；ERCC1、RRM1表达阴性的患者中位生存期及2年生存率分别均高于ERCC1,RRM1表达阳性的患者(P<0.05)；β-tubulinⅢ表达与否对NSCLC患者中位生存期及2年生存率无明显影响(P>0.05)，结论免疫组化方法检测ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ的蛋白表达情况有助于筛选NSCLC患者辅助化疗药物，并且对判断预后具有重要的指导意义。

〔关键词〕ERCC1；RRM1；β-tubulinⅢ；非小细胞肺癌

肺癌是目前我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，约80%诊断为非小细胞肺癌(NSCLC)，手术是Ⅰ~Ⅱ期及部分ⅢA期NSCLC患者主要的治疗方法之一，虽术后予以辅助化疗，但生存率改善不佳，有研究表明5年生存率较前仅改善5%左右〔1,2〕。随着基因分子诊断技术的发展，依据检测结果为肺癌患者选择合适的化疗方案，来提高疗效，延长生存期，现已发现核切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、糖核苷酸还原酶M1(RRM1)、β微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)等表达水平与化疗药物疗效及预后密切相关，本研究采用免疫组化方法检测ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC肿瘤组织中的表达，探讨三者与NSCLC临床和病理特征的关系以及对患者预后的影响。

1资料与方法

1.1临床资料收集2010年5月至2011年1月安徽省立医院胸外科手术治疗且术后行辅助化疗的Ⅰ~Ⅲ期NSCLC患者80例，男49例，女31例，年龄40～72岁；病理类型：鳞癌41例，腺癌39例；临床Ⅰ期为36例，Ⅱ期为29例，Ⅲ期为15例；淋巴结未转移29例，有转移51例。其中8例Ⅰ期患者未化疗，其余72例患者均化疗，化疗方法：采用GP方案者24例(GP方案：吉西他滨1 g/m2第1,8天+顺铂75 mg/m2)，采用TP方案者32例(TP方案：多西他赛100 mg/m2+顺铂75 mg/m2)，采用NP方案者16例(NP方案：长春瑞滨25 mg/m2第1，5天+顺铂75 mg/m2)，连续4~6周期。患者自手术后开始随访，在进行随访，末次随访时间为2013年5月30日。

1.2实验步骤一抗：ERCC1抗体(稀释比例1∶100)和β-tubulin Ⅲ抗体(稀释比例1∶100)购自北京中杉公司。RRM1抗体(稀释比例1∶100)购自福建迈新公司。二抗和S-P免疫组化试剂盒购自福州迈新公司。取上述80例患者手术标本，经石蜡包埋，切片厚4 μm；常规经二甲苯，无水酒精脱蜡，水化组织切片， 磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次×3 min ；在30%H2O2细胞通透、封闭内源性过氧化物酶(约30 min) ，暴露抗原决定族,封闭非特异；一抗孵育，放入湿盒中37℃1 h或4°过夜，二抗孵育(约30 min)，PBS 洗5次×5 min；SP反应，在37℃ 30 min，DAB显色系统显色，加滴苏木素染液复染后脱水、封片 。

1.3判定标准采取组织化学评分法，采用10个高倍视野，计数肿瘤细胞的阳性比例肿瘤细胞表达数1%~9%，计分0.1；10%~49%计分0.5；>50%计分1，并根据阳性细胞染色强度(0、1、2、3分)，二者分数相乘为该标本的最终得分，根据得分情况，划定高表达及低表达。

1.4预后评价生存期为治疗开始至死亡或随访结束的时间；计算中位生存期及2年生存率。

1.5统计学方法采用SPSS13．0软件进行χ2检验，以Kaplan-Meier法进行生存分析，采用Log-rank比较生存率。

2结果

2.1ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ在NSCLC中的表达ERCC1阳性细胞染色为细胞核染色呈黄色，RRM1及β-tubulinⅢ阳性细胞染色为细胞质染色呈黄色，见图1。

图1　NSCLC中ERCC1、 RRM1、β-tubulinⅢ 的免疫组化表达(DAB，×40)

2.2ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表达与NSCLC临床病理特征的关系80例NSCLC患者中ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ阳性表达率分别为55%(44/80)、 42.5%(34/80)、52.5%(42/80)。ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表达与年龄、性别、期别、病理类型，淋巴结转移均无明显相关性(P>0.05),见表1。

表1　ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ与

2.3ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表达在NSCLC组织中表达的相关性ERCC1和RRM1的表达呈正相关(P=0.040)，RRM1和β-tubulinⅢ的表达呈正相关(P=0.019)，ERCC1和β-tubulinⅢ的表达呈正相关(P=0.027)。

2.4ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ表达与生存期之间的关系44例ERCC1阳性患者中，中位总生存期18.6个月，2年生存率为49.6%，36例ERCC1阴性的患者中，中位总生存期22.4个月，2年生存率为58.7%，ERCC1阴性患者中位总生存期明显长于ERCC1阳性患者(P=0.043)，Ⅰ期ERCC1阳性和阴性患者的中位生存期分别是33.4个月33.1个月，Ⅱ期和Ⅲ期ERCC1阴性中接受铂类化疗的患者的中位生存期明显高于阳性患者，Ⅱ期ERCC1阴性患者和阳性患者的中位生存期分别是26.4个月和23.5个月,Ⅲ期ERCC1阴性患者和阳性患者的中位生存期分别是19.4个月和16.3个月。34例RRM1阳性患者中，中位总生存期18.9个月，2年生存率为42.5%，46例RRM1阴性患者中,中位总生存期21.6个月，2年生存率为59.4%，RRM1阴性患者中位总生存期明显长于RRM1阳性者(P=0.034)，Ⅰ~Ⅲ期RRM1阴性患者的中位生存期明显高于阳性患者，Ⅰ期RRM1阴性患者和阳性患者的中位生存期分别是个34.1个月和31.6个月，Ⅱ期RRM1阴性患者和阳性患者的中位生存期分别是25.2个月和22.5个月,Ⅲ期RRM1阴性患者和阳性患者的中位生存期分别是个18.2月和16.0个月。42例β-tubulinⅢ阳性患者中,中位总生存期18.1个月，2年生存率为44.1%，38例β-tubulinⅢ阴性患者中,中位生存期19.4个月，2年生存率为49.7%，β-tubulinⅢ阴性患者中位总生存期与β-tubulinⅢ阳性者无差别(P=0.94)，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ阴性和阳性患者的中位生存期分别是：33.5个月，26.0个月，17.3个月和32.9个月，27.1个月，16.8个月。

3讨论

目前肺癌术后治疗以化疗为主，因个体之间的差异性，不同病理类型和分期的肺癌患者，对标准化疗敏感性差异较大，因此近年来提出了针对不同患者进行个体化治疗的概念通过检测ERCC1、RRM1 、β-tubulinⅢ基因表达，表皮生长因子受体(EGFR)等基因体细胞突变等分子标记物，来进行制定个体化治疗方案，提高化疗效率，并具有预测预后的作用。本研究发现，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表达阳性率与患者的临床特征均无明显相关性，并显示ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ蛋白表达两两之间呈正相关，可作为指导临床的标志物。

ERCC1是DNA损伤修复途径中最主要的基因之一，则具有损伤识别和切除5’端的双重作用，在核苷酸切除修复中起到限速或调节的重要作用，是DNA修复的一个重要途径。铂类药物抗肿瘤作用的主要靶点为DNA，其细胞毒性主要在于与细胞内亲核DNA结合，形成铂-DNA加合物，影响DNA复制转录，导致其致命损伤。ERCC1作为核苷酸切除修复的限速酶参与DNA的修复并且有可能作为使用铂类化疗药的预测的标记物〔3〕，Simon等〔4〕根据ERCC1基因表达水平进行研究，结果证明ERCC1低表达者用铂类治疗，ERCC1高表达者用非铂治疗，可以提高肺癌治疗的有效率。ERCC1基因表达及多态性与NSCLC的发病、临床特点、生物学行为、预后等存在一定的相关性〔5〕。本研究发现ERCC1基因蛋白表达阴性其中位生存期及2年生存率明显好于阳性患者(P=0.043)，与Vilmar等〔6〕研究结果相似。Olaussen等〔7〕报道提示对于早期肺癌患者ERCC1表达阳性具有保护作用，对于ERCCI阴性的患者随机接受辅助化疗明显延长生存时间，本研究Ⅰ~Ⅲ期ERCC1阴性患者接受化疗ERCC1低表达患者生存期长于ERCC1高表达者与其相符。对于正常人群，DNA修复基因可以降低肺癌的发病风险，而对于肺癌患者，DNA修复基因可以导致化疗药物的耐药，使化疗疗效降低。

RRM1是RNA合成的前体，它能使核糖核苷酸还原成为脱氧核糖核苷酸，是DNA 合成通路中的限速酶，是盐酸吉西他滨(GEM)耐药的一个重要预测指标 。吉西他滨是嘧啶类抗代谢药物，在细胞内经过核苷激酶的作用转化成具有活性的二磷酸核苷(dFdCDP)及三磷酸核苷(dFdCTP)，通过抑制DNA合成而发挥细胞毒作用，吉西他滨干扰了核苷酸还原酶的功能，因此推测RRM1的表达可能与吉西他滨耐药有关。Zheng等〔8〕研究RRM1在体内外的表达，发现RRM1在肿瘤组织当中高表达对铂类+吉西他滨化疗治疗中具有重要的预测指标。Rosell等〔9〕检测了100例GEM 方案治疗的晚期NSCLC患者标本的RRM1 mRNA发现RRM1 mRNA低表达者明显受益，中位生存期高于高表达者。国外研究〔10〕发现早期非小细胞肺癌术后RRM1患者高表达提示预后较好，而晚期接受GP方案化疗的患者RRM1高表达提示预后较差，国内外文献显示RRM1的基因表达与吉西他滨耐药相关，肺癌患者RRM1高表达的患者比低表达的患者较难从吉西他滨与铂类联合化疗中获益。本研究也证实早期RRM1阳性表达组的中位生存期长于RRM1阴性，而晚期接受化疗的RRM1阴性表达组的中位生存期明显长于阳性表达组,RRM1的表达情况同肺癌肿瘤细胞的生物学行为、肿瘤的进展及预后存在相关关系。

β-tubulinⅢ蛋白是一类微管蛋白，是构成细胞骨架的主要成分，在细胞有丝分裂当中起重要作用，研究表明其表达对紫杉类耐药有关。国外对NSCLC术后病理进行免疫组化检查，结果显示β-tubulinⅢ表达对紫杉醇具有相关性，可作为重要生物标记物预测多西他赛的敏感性，Seve等〔11〕临床研究分析显示β-tubulinⅢ高表达者预后差，但较低表达者似乎更能从铂类+紫杉醇的辅助化疗中获益，另一研究表明分组给予紫杉类加铂类，或者吉西他滨加铂类方案，结果显示β-tubulinⅢ低表达组对紫杉加铂类的受益程度明显高于高表达组及吉西他滨组。Reiman等〔12〕研究β-tubulinⅢ阳性者在早期非小细胞肺癌具有预测性作用，β-tubulinⅢ高表达时可从长春瑞滨加顺铂的辅助化疗中获益；而低表达时可从紫杉加铂类的化疗中获益。Dumontet等〔13〕在β-tubulinⅢ表达与预后关系的研究中发现，β-tubulinⅢ高水平表达患者的无疾病生存期明显低于低表达者，Vilmar等〔14〕也报道，β-tubulinⅢ低水平表达患者有着更长的无疾病生存期，及更高的总生存率，是重要的预测指标。本研究结果显示，β-tubulinⅢ性高表达与低表达比较时，患者中位生存期和2年生存率较为阴性者未见明显降低，Ⅰ~Ⅲ期β-tubulinⅢ阴性和阳性患者的中位生存期未见明显差异(P>0.05)，虽与上述研究存在一定差异，但本研究不能评价对多西他赛敏感性的关系。

肺癌的发生与发展过程当中包含了多种基因的表达，并且一些基因与肿瘤耐药有关，本研究回顾性分析ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ三者关系，发现三者呈明显的正相关性，这可能与肺癌的发生，发展有着密切的关系，此外研究证实ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ等分子标志物的表达状态可能仅对化疗的疗效及预后有一定预测价值，而ERCC1，RRM1的低表达具有更长的生存期。因此对ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因蛋白的检测，具有临床价值，值得进一步研究。

4参考文献

1Soo RA,Wang LZ,Thaml S,etal. A multicentre randomised phase Ⅱstudy of carboplat in in combination with gemcitabine at standard rate or fixed dose rate in fusion in patients with advanced stage non-small-cell lung cancer〔J〕.Ann Oncol,2006;17(7):1128-331.

2Mountain CF,Dresler CM.Regional lymph node classification for lung cancer staging〔J〕.Chest,1997;111:1718-23．

3Lee HW,Choia YW,Han JH,etal.Expression of excision repair cross-complementation group 1 protein predicts poor outcome in advanced non-small cell lung cancer patients treated with platinum-based doublet chemotherapy〔J〕. Lung Cancer,2008:59:95-104.

4Simon G,Sharma AX,etal.Feasibility and efficacy of molecular analysis directed indualized therapy in advanced non-small-cell lung cancer〔J〕.Clin Oncol,2007;25(19):2741-6．

5Sarries C,Haura EB,Roig B,etal.Polymorphisms of the DNA genes Erccl and lung cancer risk〔J〕.Cancer Epidemiol Biomark Prevent,2001;10(2):119-23．

6Vilmar AC,Santoni-Rugiu E,Sorensen JB.ERCC1 and histopathology in advanced NSCLC patients randomized in a large multicenter phase Ⅲ trial〔J〕.Ann Oncol,2010:21:1817-24.

7Olaussen KA，Ariane D，Fouret P，etal．DNA repair by ERCC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant 〔27〕 chemotherapy〔J〕.N Engl J Med,2006;355:983-91．

8Zheng Z,Chen T,Li X,etal.DNA synthesis and repair genes RRM1 and ERCC1 in lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2007;22:800-8.

9Rosell R,Danenberg KD,Alberola V,etal.Ribonucleotide reductase messenger RNA expression and survival ingemcitabine cisplatin-treated advanced non-small-cell lung cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res,2004;10(4):1318-25．

10Ceppi P，Volante M，Novello S，etal．ERCC1 and RRM1 gene expressions but not EGFR are predictive of shorter survival in advanced non small-cell lung cancer treated with cisplatin and gemcitabine〔J〕.Ann Oncol,2006;17(12):1818-25．

11Seve P,Lai R,Ding K,etal.Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin vinorelbine chemotherapy in operable non-small cell lung cancer:analysis of NCIC JBR 〔J〕.Clin Cancer Res,2007;13(3):994-9．

12Reiman T,Lai R,Veillard AS,etal.Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer:analysis of four randomized trials〔J〕 Ann Oncol,2012:23:86-93.

13Dumontet C,Isaac S,Souquel PJ,etal.Expression of class Ⅲ beta tubulin in non small cell lung cancer is correlated with resistance to taxane chemotherapy〔J〕．Bull Cancer，2005;92(2):25-30．

14Vilmar AC,Santoni-Rugiu E.Class Ⅲ β-tubulin in advanced NSCLC of adenocarcinoma subtype predicts superior outcome in a randomized trial〔J〕.Clin Cancer Res,2011;17(15):5205-14.

〔2014-05-17修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)

〔中图分类号〕R734.2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1113-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.042

通讯作者：徐美青(1962-)，男，教授，硕士生导师，主要从事胸外科疾病研究。

基金项目：卫生部分子诊断技术在肺癌个体化治疗中的应用研究课题资助项目(No.W2012F115)

第一作者：罗静(1985-)，男，硕士，主要从事胸外科疾病研究。