骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠早期炎性反应的影响

李淑娟　张天首　王子薇　张学军　李艳秋

(吉林大学口腔医院，吉林　长春　130021)



骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠早期炎性反应的影响

李淑娟张天首王子薇张学军李艳秋

(吉林大学口腔医院，吉林长春130021)

〔摘要〕目的探讨骨髓间充质干细胞对失血性休克大鼠血清炎性因子及重要脏器的影响。方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组(n=20)。改良Wiggers法制备大鼠出血性休克模型，休克持续90 min。治疗组在复苏前给予106个第3代骨髓间充质干细胞磷酸盐缓冲液(PBS)悬液1 ml，假手术组和模型组给予相同体积PBS溶液。分别于复苏后6、12、24、48、72 h取血清，酶联免疫试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-1β、IL-6和IL-10水平，苏木素-伊红(HE)染色观察心、肝、肺、肾病理损伤。结果治疗组血清TNF-α和IL-6在复苏后12~72 h内较模型组显著下降(P<0.05)；治疗组血清IL-1β在复苏后6~12 h内较模型组下降显著(P<0.05)；治疗组IL-10水平在复苏后6~48 h内均较模型组有显著升高(P<0.05)。骨髓间充质干细胞减轻肺、肝、肾、心等器官的炎性细胞浸润。结论骨髓间充质干细胞能调节失血性休克早期重要炎性因子水平，促进机体促炎-抗炎系统平衡。

〔关键词〕骨髓间充质干细胞；失血性休克；炎症因子；免疫调节

骨髓间充质干细胞具有极低的免疫原性和独特的免疫调节功能〔1〕，在多种组织损伤和修复中表现出良好的免疫调节能力，但对失血性休克后免疫失衡的影响尚未研究。本研究利用培养的大鼠骨髓间充质干细胞在大鼠失血性休克模型，调查间充质干细胞对炎性细胞因子的表达的影响，以证实其减轻失血性休克后炎性反应的效果，从而探讨失血性休克临床救治的新思路。

1材料与方法

1.1实验动物特殊清洁级(SPF)级SD大鼠，质量250～300 g。购于第四军医大学实验动物中心。本实验经第四军医大学附属唐都医院实验动物管理委员会批准。

1.2主要试剂及仪器DMEM-LG培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；PE anti-rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106(美国Biolegent公司)；戊巴比妥钠(第四军医大学生物技术中心)；大鼠肿瘤坏死因子(TNF)-α 酶联免疫试验(ELISA)试剂盒、白介素(IL)-1β ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒、IL-10 ELISA试剂盒(美国RD&D公司)；链霉素、氨苄青霉素(华北制药有限公司)。CO2恒温孵育箱(美国Thermo公司)；液闪计数仪(美国Beckman公司)；IMT-2型倒置生物学显微镜(日本Olympus公司)；HH-4型恒温水浴箱(金坛富华电器有限公司)；流式细胞仪(美国BD FACSAriaTM)；高速调温离心机(美国Sigma公司)。

1.3大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增和鉴定大鼠颈椎脱臼处死，取双后肢胫骨和股骨。无菌2 ml注射器吸取培养基迅速反复冲洗骨髓腔多次，直至冲出大部分骨髓。加入含10%胎牛血清的DMEM-LG培养基，无菌玻璃管反复吹打，直至细胞充分重悬于培养基。调整细胞浓度至1×106/cm2,接种细胞于75 cm2的塑料培养瓶中，37℃,5% CO2孵箱培养、传代。取第3代骨髓间充质干细胞弃去培养基，PBS溶液冲洗后弃去，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞皱缩变圆并部分脱落时加入胎牛血清终止消化，反复吹打贴壁细胞至绝大部分脱落，制成细胞悬液。离心取上清，PBS溶液调整细胞浓度至1×107/ml。加入PE 抗鼠 CD29、PE 抗鼠CD34、PE 抗鼠CD45、PE 抗鼠CD90、PE 抗鼠 CD106。避光，4℃冰箱内孵育30 min。将制备好的样品行流式细胞仪鉴定，Cellquest软件分析数据。

1.4大鼠失血性休克模型3%戊巴比妥钠麻醉大鼠后固定。分离左股动脉插管，按3 mg/kg体重输注肝素钠溶液，连接心电监护仪持续监测平均动脉压(MAP)。分离右股动脉，插管连接无菌注射器。急性快速放血至MAP降至40 mmHg，而后间断放血或回输失血维持MAP在30~40 mmHg水平90 min，90 min后回输全部失血进行复苏。

1.5实验分组假手术组：大鼠麻醉后固定，分离左右股动脉插管，不失血，不输注任何溶液，90 min后拔管结扎血管后缝合切口。(2)失血性休克模型组：大鼠麻醉固定，分离左右股动脉插管，均造失血性休克模型，90 min后回输全部失血(5~6 min回输1 ml失血)，之后输注PBS溶液1 ml，结扎血管，缝合切口。(3)骨髓间充质干细胞治疗组：失血 90 min后回输全部失血(5~6 min回输1 ml失血)，之后输注含有106个骨髓间充质干细胞的PBS溶液1 ml，结扎血管，缝合切口。各组于复苏后6、12、24、48、72 h取4只大鼠样本待检。

1.6血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA测定分别于复苏后各时间点取大鼠下腔静脉血，离心取上清，-80℃冷冻保存备检。检测按照ELISA说明书步骤进行。

1.7各组大鼠重要脏器的HE染色各组大鼠处死后，取下心、肝、肺、肾脏，PBS冲洗后4%甲醛固定24 h以上。高浓度酒精脱水，浸蜡包埋。蜡块切片5~8 μm。二甲苯脱蜡，酒精伊红染色液染色2~3 min。纯酒精脱水后二甲苯透明。加拿大树胶封固、观察。

1.8统计学分析用SPSS13.0软件行方差分析和t检验。

2结果

2.1大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、传代将骨髓内细胞离心重悬后接种于75 cm2塑料培养瓶后，倒置显微镜下可见大量细胞悬浮于培养基中。12 h即见部分细胞贴壁，呈大小不等圆形，并开始繁殖。48~72 h后可见不规则形、三角形，并伴有小突起。8~10 d后，细胞大多呈梭形，突起明显，排列呈旋涡状。当传代至第3代时，纺锤形和梭形细胞增多明显，呈典型的成纤维样细胞结构，生长均匀，形态趋向一致。流式细胞仪将第3代骨髓间充质干细胞进行表面标记物检测，骨髓间充质干细胞表明高表达CD29、CD90、CD106、CD44，低表达CD34、CD45，表达率分别98.4%、99.6%、50.2%、17.2%、1.5%、4.7%。

2.2各组大鼠血清炎性因子浓度变化休克复苏后相对于假手术组，模型组的TNF-α、IL-1β、IL-6浓度显著上升(P<0.05)，而治疗组TNF-α、IL-1β、IL-6浓度在各时间点均比模型组明显下降(P<0.05)。模型组IL-10的浓度较假手术组显著下降(P<0.05)；6~48 h内，治疗组IL-10的浓度均比模型组升高(P<0.05)，见图1。

与模型组比较：1)P<0.05图1　各组大鼠血清炎性因子浓度变化

2.3脏器染色观察模型组肺组织正常结构遭到破坏，肺间质水肿，肺泡壁明显增宽，肺泡腔含气量减少，大量炎症细胞浸润。输注骨髓间充质干细胞则炎细胞浸润减少，肺组织结构相对完整。休克后大鼠肝脏结构排列紊乱，肝细胞有空泡样变性，胞质呈疏松样改变，汇管区可见大量炎性细胞浸润，小叶中央静脉扩张充血，给予骨髓间充质干细胞复苏72 h后，肝结构排列正常，炎性细胞浸润减少。休克后肾间质有少量淤血，肾小管上皮细胞空泡变性，肾正常结构遭破坏，大量炎性细胞浸润。骨髓间充质干细胞复苏后72 h可见病损区新的毛细血管再生，炎细胞浸润减少。模型组心肌细胞浑浊肿胀，间质水肿，横纹不规则，胞核完整或稍大，炎性细胞浸润。输注骨髓间充质干细胞72 h后，心肌排列整齐，炎性细胞减少，胞核完整。

3讨论

骨髓间充质干细胞可通过多种免疫抑制介质进行多靶位、多途径的免疫调节、控制炎性反应。对组织缺血再灌注损伤具有良好的修复功能和调节炎性反应平衡的能力〔2~4〕。出血性休克复苏后免疫功能紊乱是全身炎性反应综合征的发病基础，表现为过度的促炎反应和明显抑制的抗炎反应〔5〕。目前的各种治疗和预防措施效果有限。研究表明，CD4+CD25+Tregs细胞〔6〕是骨髓间充质干细胞发挥免疫调节作用的重要效应细胞。CD4+CD25+Tregs细胞是一群具有免疫调节能力、控制免疫病理损伤的T细胞群，主要来源于CD4+CD8-细胞，特征是能表达某种或某些细胞表面分子与靶细胞表面受体相互作用，使靶细胞休止于细胞周期G0/G1期而停止增殖，从而介导免疫抑制作用〔7~9〕。CD4+CD25+Tregs细胞特异性分子标志物Foxp3是自身免疫的关键性调节物质，直接控制各种细胞因子的产生，其基因表达产物Scurfin蛋白是一种转录的阻遏物，可结合至细胞因子基因的启动区，减少细胞因子的产量，而缺乏Scurfin可引起迅速的淋巴细胞增生性疾病，对免疫环境的自我稳定十分重要。骨髓间充质干细胞对CD4+CD25+Tregs细胞的调节可能是其在出血性休克复苏后发挥免疫调节的主要途径。骨髓间充质干细胞对出血性休克的免疫调节提供了新方法，但仍有许多问题需要解决，随着对休克病理机制更加深入的研究、对骨髓间充质干细胞认识的不断增多，骨髓间充质干细胞将有可能用于临床出血性休克的救治。

4参考文献

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8Kim Jm,Lee ST,Chu K,etal.Systemic transplatation of human adipose stem cells attenuated cerebral inflammation and degeneration in a hemorrhagic stroke model〔J〕.Brain Res,2007;1183(4):42-50.

9Selmani,Naji,etal.Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells〔J〕.Stem Cells,2008;26(1):212-22.

〔2015-11-03修回〕

(编辑李相军)

〔中图分类号〕R39

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)05-1044-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.009

通讯作者：李彤(1958-)，女，副主任医师，主要从事临床口腔麻醉学研究。

基金项目：吉林省产业技术研究与开发项目(吉发改高技〔2013〕779号)

第一作者：李淑娟(1969-)，女，主管护师，主要从事口腔护理学研究。