Toll样受体3基因缺陷促进四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化损伤

薛如意　张丹瑛　吴昊　刘韬韬　董玲　沈锡中

(复旦大学附属中山医院消化内科，上海　200032)



·论著·

Toll样受体3基因缺陷促进四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化损伤

薛如意张丹瑛吴昊刘韬韬董玲沈锡中

(复旦大学附属中山医院消化内科，上海200032)

摘要目的： 探讨Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)基因缺陷对于四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型肝纤维化损伤程度的影响。方法： 将20只野生型雄性小鼠和20只TLR3基因缺陷型(TLR3-/-)雄性小鼠分别分为野生型对照组、野生型造模组、TLR3-/-对照组和TLR3-/-造模组，每组各10只。对照组腹腔注射玉米油，造模组腹腔注射四氯化碳。造模8周后采集血液标本，应用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)水平；采用马松三色染色法对肝组织胶原沉积程度进行分析；采用α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)免疫组织化学染色法检测肝星状细胞的激活情况；应用试剂盒检测肝组织中的羟脯氨酸含量；采用实时荧光定量PCR法检测肝组织中纤维化标志物Ⅰ型胶原、炎性因子[包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) ]以及促纤维化分子[包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1( tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)]的表达。结果： TLR3基因缺陷对于四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠血清中的ALT、AST、TBIL、ALB水平变化无影响。TLR3基因缺陷可加重四氯化碳诱导的肝组织胶原沉积和肝星状细胞激活；促进四氯化碳诱导的小鼠肝组织中羟脯氨酸的升高；使四氯化碳诱导的肝纤维化标志物Ⅰ型胶原增多，也使肝组织中炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纤维化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR表达升高。结论： TLR3基因缺陷可促进四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝组织中的胶原沉积和肝星状细胞激活，促进肝组织炎性因子释放，使肝促纤维化分子上调。以上提示，TLR3是肝纤维化病理过程中的一个保护性基因。

关键词Toll样受体3；基因缺陷小鼠；四氯化碳；肝纤维化

Toll-Like Receptor 3 Gene Deficiency Aggravates Carbon Tetrachloride-Induced Liver Fibrosis in Mice

XUERuyiZHANGDanyingWUHaoLIUTaotaoDONGLingSHENXizhong

DepartmentofGastroenterologyandHepatology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the effect of Toll-like receptor 3(TLR3) gene deficiency on the degree of liver fibrosis in mouse model of carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis.Methods： A total of 20 wild-type male mice and 20 male mice with TLR3 gene deficiency(TLR3-/-) were divided into wild-type control group and wild-type model group,TLR3-/-control group and TLR3-/-model group, respectively, with 10 mice in each group.The control group was injected with corn-oil by intraperitoneal injection while the model group was injected with CCl4by intraperitoneal injection.After 8 weeks,blood sample was collected and serum level of alanine aminotransferase(ALT), aspartate transaminase(AST), total bilirubin(TBIL), and albumin(Alb) was analyzed by automatic biochemical analyzer. And the degree of collagen deposition in liver tissue was evaluated by Masson trichrome staining.And the activation of hepatic stellate cells was detected by immunohistochemistry staining of α-smooth muscle actin(α-SMA). And hydroxyproline content of liver tissue was detected with detection kit.Furthermore, real-time fluorescence polymerase chain reaction was used to detect the expression of liver fibrotic marker type I collagen,and inflammatory cytokines including tumor necrosis factor-alpha(TNF-α), interleukin-6(IL-6) and monocyte chemotactic protein-1(MCP-1), as well as pro-fibrotic molecule including transforming growth factor-beta(TGF-β),tissue inhibitor of metalloproteinase 1(TIMP1) and platelet-derived growth factor receptor(PDGFR).Results： TLR3 gene deficiency had no effect on CCl4-induced change regarding serum level of ALT,AST,TBIL,ALB.TLR3 gene deficiency aggregated the CCl4-induced collagen deposition and hepatic stellate cell activation in liver tissue. And it promoted the CCl4-induced elevation of hydroxyproline content and expression increase of fibrotic marker type I collagen. Furthermore, the expression increase of inflammatory cytokines including TNF-α,IL-6 and MCP-1,as well as that of pro-fibrotic molecule including TGF-β,TIMP1 and PDGFR, was promoted.Conclusions： TLR3 gene deficiency could promote liver collagen deposition and hepatic stellate cell activation in mouse model of CCl4-induced liver fibrosis, and it could promote inflammatory cytokine release and pro-fibrotic molecule up-regulation. All above suggest that TLR3 is a protective gene during liver fibrosis pathological process.

Key WordsToll-like receptor 3;Mouse with Gene deficiency;Carbon tetrachloride;Liver fibrosis

肝纤维化是许多慢性肝脏疾病晚期共有的病理生理过程，其病理特征为多种致病因素引起的肝脏纤维结缔组织的异常增生。在早期阶段，肝纤维化是可逆的。但是，如果肝损伤的原因持续存在，长期肝纤维化可演变为肝硬化，使肝脏发生永久的不可逆的损伤，甚至发展为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。近年来，模式识别受体所介导的肝脏炎性反应和肝纤维化间的关系已成为肝纤维化发病机制研究中的一个新热点[2-5]。

本研究选用Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)基因缺陷型(TLR3-/-)小鼠，通过化学损伤(四氯化碳)诱导肝纤维化模型，探讨TLR3基因缺陷对于肝纤维化指标和肝炎性反应指标的影响。

1资料与方法

1.1实验动物和材料野生型小鼠B6129SF2/J和TLR3-/-小鼠B6.129S1-Tlr3tm1Flv/J购自美国Jackson实验室。四氯化碳(Sigma-31996)、玉米油(Sigma-C8267)、马松三色染液(Sigma-HT15)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)抗体(Sigma-A2547)购自美国Sigma公司；多聚甲醛和10%甲醛固定液购自湖北武汉博士德生物有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2通过四氯化碳诱导建立肝纤维化模型将雄性8～10周龄(25～30 g)的野生型小鼠20只和TLR3-/-小鼠20只饲养于复旦大学动物部无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级动物房，采用12 h光/暗周期，给予常规食物和水。选取野生型和TLR3-/-小鼠各10只为模型组，腹腔注射四氯化碳(用玉米油稀释至20%)，给药剂量为6 μL/g，每周3次，连续8周。另选取野生型和TLR3-/-小鼠各10只为对照组，腹腔注射与模型组等量的玉米油。8周后处死所有小鼠，小鼠处死前12 h禁食、禁饮。

1.3肝功能和肝纤维化检测应用美国Beckman Coulter有限公司生产的AU5800系列全自动生化分析仪检测小鼠血清中的肝功能指标，包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、总胆红素(total bilirubin，TBIL)、白蛋白(albumin，ALB)。肝纤维化检测：将小鼠肝脏置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，采用马松三色染色法分析肝组织胶原沉积程度；采用α-SMA免疫组织化学染色法检测肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活情况以确定肝纤维化的状态；另外应用南京建成生物有限公司的试剂盒测定肝组织羟脯氨酸含量。

1.4实时荧光定量PCR取小鼠肝组织0.1 g，加入1 mL TRIzol(美国Invitrogen公司)后冰上匀浆。提取肝脏总RNA，应用美国赛默飞世尔科技公司的Nanodrop微量紫外分光光度计检测RNA浓度，按照宝生物工程(大连)有限公司反转录试剂盒说明书进行反转录。应用美国ABI公司的7500型实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR，检测肝组织纤维化标志物Ⅰ型胶原、炎性因子[包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和 单核细胞趋化因子1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)]以及促纤维化分子[包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)和血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)]的mRNA表达水平，以ΔΔC t法计算， 最终以2-ΔΔC t值作为基因表达的定量值，相关引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见表1。

表1　实时荧光定量PCR引物序列

注：内参照GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

2结果

2.1各组小鼠肝功能指标比较与相应对照组比较，野生型和TLR3-/-小鼠造模组血清AST、ALT、TBIL值均明显增高，ALB降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；TLR3-/-造模组小鼠血清AST、ALT、TBIL和ALB与野生型造模组的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

±s)

注：与野生型对照组比较，*P<0.05；与TLR3-/-对照组比较，#P<0.05

2.2各组小鼠肝纤维化指标比较与相应对照组比较，野生型和TLR3-/-小鼠造模组肝组织中胶原纤维沉积明显较多，表现为马松三色染色阳性细胞比例增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与野生型造模组比较，TLR3-/-造模组小鼠肝组织中胶原纤维沉积较多，表现为马松三色染色阳性细胞比例增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表3。

表3　各组小鼠肝组织马松三色染色及α-SMA免疫组织

注：与野生型对照组比较，*P<0.05；与TLR3-/-对照组比较，#P<0.05；与野生型造模组比较，△P<0.05

A：野生型对照组；B：TLR3-/-对照组；C：野生型造模组；D：TLR3-/-造模组图1　各组肝组织马松三色染色(×100)

与对照组比较，野生型和TLR3-/-小鼠造模组HSC激活明显增加，表现为α-SMA免疫组织化学染色阳性细胞比例增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；与野生型造模组比较，TLR3-/-造模组小鼠HSC激活明显增加，表现为α-SMA免疫组织化学染色阳性细胞比例增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表3。

A：野生型对照组；B：TLR3-/-对照组；C：野生型造模组；D：TLR3-/-造模组图2　各组肝组织α-SMA免疫组织化学染色(×100)

2.3各组小鼠肝组织中羟脯氨酸含量比较与相应对照组比较，野生型和TLR3-/-小鼠造模组肝组织中羟脯氨酸含量均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)； 与野生型造模组比较， TLR3-/-造模

组小鼠肝组织中羟脯氨酸含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

±s)

注：与野生型对照组比较，*P<0.05；与TLR3-/-对照组比较，#P<0.05；与野生型造模组比较，△P<0.05

2.4实时荧光定量PCR检测各组小鼠肝组织中纤维化标志物Ⅰ型胶原及炎性因子和促纤维化分子的表达情况与相应对照组比较，野生型和TLR3-/-小鼠造模组肝组织中纤维化标志物Ⅰ型胶原，炎性因子TNF-α、IL-6和MCP-1以及促纤维化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的表达水平上调，差异均有统计学意义(P<0.05)；与野生型造模组比较，TLR3-/-造模组小鼠肝组织中纤维化标志物Ⅰ型胶原，炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纤维化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5　各组小鼠肝组织纤维化标志物Ⅰ型胶原及炎性因子和促纤维化分子的表达水平(2- ΔΔC t)

注：与野生型对照组比较，*P<0.05；与TLR3-/-对照组比较，#P<0.05；与野生型造模组比较，△P<0.05

3讨论

肝纤维化受到多种先天免疫系统组件的控制，包括体液因子(如补体和干扰素)、吞噬细胞(如中性粒细胞和巨噬细胞)、淋巴细胞(如NK细胞和NKT细胞)和模式识别受体[如Toll样受体(TLR)][6]。肝脏负责完成80%～90%的先天免疫蛋白(包括补体和模式识别受体)的生物合成。小鼠肝淋巴细胞含有10%的NK细胞，而大鼠和人肝淋巴细胞含有30%～50%的NK细胞。获得性免疫系统在肝脏中并不活跃，因为肝脏是T细胞凋亡的主要器官。先天免疫系统在对病原体的先天防御以及肝损伤、修复和纤维化进程中发挥关键作用。

先天免疫系统通过多种模式识别受体识别细菌产物的成分，受体与病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)识别并结合后，调节肝纤维化的发生。其信号机制包括活化核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)，拮抗细胞凋亡，诱导DNA损伤，引起组织损伤修复反应，抑制细胞自噬，改变氧化应激和线粒体应激状态，利用NK细胞杀伤HSC等。TLR对病原体相关分子模式的识别是天然免疫的基础，使机体能对病原体作出快速有效的反应，启动细胞活化和炎性信号转导。

TLR在肝脏中有9种成员，即TLR1~9。研究[6]显示：TLR4被细菌内毒素活化后，可以激活NF-κB途径，引起HSC活化，促进肝纤维化。我们[7]近期发现，TLR2受体活化后，可以通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和NF-κB信号通路，引起HSC活化，促进肝纤维化。本研究选用TLR3基因缺陷型小鼠，通过四氯化碳诱导肝纤维化模型，探讨了TLR3对于肝纤维化的影响。结果发现，TLR3基因缺陷促进了化学毒物诱导肝纤维化，表现为：TLR3基因缺陷增加了胶原纤维的沉积，增强了HSC的激活，提高了肝组织中羟脯氨酸的含量；TLR3增加了肝组织纤维化标志物之一的Ⅰ型胶原，肝组织炎性因子TNF-α、IL-6和 MCP-1以及促纤维化分子TGF-β、TIMP1和PDGFR的水平。

TLR3在肝组织中主要分布于NK细胞和枯否细胞。其中，NK细胞对于HSC的活化有重要的调节作用。研究[8]发现，TLR3受体可以调节NK细胞的功能。在体外用TLR3的配体——多聚肌苷酸多聚胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid，poly I:C)处理NK细胞，可以提高NK细胞的细胞杀伤毒性，杀伤活化的HSC，从而抑制HSC的活化。在小鼠体内实验也发现，poly I:C处理小鼠造成TLR3活化后，能够提高NK细胞的细胞杀伤毒性。基于这些研究和本研究的结果，我们提出了这样的假设：TLR3受体可能是一个肝脏重要的抗纤维化受体，它通过调节NK细胞的杀伤毒性，抑制HSC的活化，抑制炎性因子和促纤维因子的释放，从而抑制胶原沉积的纤维化进程，而将这一重要的抗纤维化受体基因敲除后，可加重肝纤维化进程。本研究结果为抗肝纤维化治疗提供了新的潜在靶点，以TLR3受体为干预靶点的抗纤维化策略可能有潜在的临床应用价值。

参考文献

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中图分类号R575.2

文献标志码A

通讯作者薛如意，E-mail: xue.ruyi@zs-hospital.sh.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81572308)