HPV16E6对Hippo途径的效应分子YAP的影响*

龙洪清，向　赟，张　振，郑　义

(1.湖北科技学院临床医学院肿瘤学与核医学教研室，湖北 咸宁 437100；

2.武汉市妇幼儿童健康中心检验科；3.南方医科大学附属广州花都区人民医院中心实验室)



HPV16E6对Hippo途径的效应分子YAP的影响*

龙洪清1，向赟2，张振2，郑义3

(1.湖北科技学院临床医学院肿瘤学与核医学教研室，湖北 咸宁 437100；

2.武汉市妇幼儿童健康中心检验科；3.南方医科大学附属广州花都区人民医院中心实验室)

摘要：目的 研究HPV16E6和Hippo途径的效应分子YAP的相关性。方法 用Western Blot、Real-Time qRT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜观察Caski细胞HPV16E6过表达或被敲减后YAP的表达和定位及其直接作用的下游基因结缔组织生长因子(CTGF)的表达。结果 Caski细胞HPV16E6被敲减或过表达时,YAP相应地表达减少或增加，磷酸化YAP增加或减少，YAP下游分子CTGF的mRNA表达相对应减少或升高。YAP主要定位于胞浆或胞核胞浆中，磷酸化YAP主要定位于胞浆，非磷酸化YAP主要定位于胞核。结论 HPV16E6诱导Hippo途径失常，胞核YAP表达升高，CTGF表达相应增多，提升HPV16E6的致癌性。Hippo途径可能是治疗高危性HPV16感染相关疾病的候选药物作用途径之一。

关键词：人乳头瘤病毒；E6蛋白；Hippo信号途径；YAP

高危型人乳头瘤病毒(hr-HPV)持续感染引起多种疾病，如宫颈癌、口咽癌。Ghittoni R等[1]认为高危型HPV感染致宫颈癌是一个复杂的过程，绝大部分高危型HPV感染后能自动消退而不产生任何病变，HPV持续感染常常导致发生宫颈内鳞状上皮瘤(CINI-III)，甚至发展恶化为侵袭性宫颈癌，这一步与宿主细胞累积染色体受损、癌基因激活和抑癌基因失活有关。Liu等[2]认为宫颈癌细胞中HPV呈整合状态，E6、E7基因表达的早期癌蛋白在细胞周期调控及凋亡调节中发挥重要作用，其持续表达是肿瘤细胞发生恶性转化和维持恶性特征所必需。Park等[3]认为Hippo细胞信号途径与细胞不对称分裂、肿瘤干细胞、器官大小的调控、细胞接触抑制、细胞极性和上皮间质转化(EMT)等密切相关。YAP(Yes-associated protein)是Hippo信号途径中的下游效应分子，是一个重要的人原癌基因。

高危型HPV病毒感染粘膜上皮细胞后，如何通过Hippo途径及其效应分子发挥致癌作用，是我们一直关注的焦点。本实验研究试图探讨HPV16E6如何通过Hippo途径的效应分子YAP提升其致癌性，旨在进一步明确高危型HPV16病毒感染致癌的发病机制，为肿瘤治疗提供新靶点寻找依据。

1材料与方法

1.1质粒和siRNAHPV16E6的siRNA：5′-TTATGCATAGTATATAGAGgaagcttgCTCTATATACT

ATG CATAA-3′由上海吉玛生物科技有限公司合成。质粒pCDNA3.1(+)HPV16E6为深圳研究生院分子生物学实验室，经测序证明该质粒的准确性。

1.2细胞培养Caski细胞(人宫颈癌上皮细胞，含有完整HPV-16和HPV-18相关序列，每个细胞内HPV-16大约600个拷贝)购自武汉普诺赛(Procell)生命科技有限公司。用含10%胎牛血清(FBS)、50U/ml青霉素和50μg/ml的链霉素的DMEM(Dulbecco's modied Eagle medium)培养。比对肿瘤细胞C33A细胞(一种没有HPV病毒感染的宫颈癌细胞系)，购自武汉大学典型物种保存中心。

1.3转染Caski细胞以细胞密度为1×105细胞接种到6孔细胞培养板中，待细胞有80%以上汇合时，转染试剂FuGene6(Roche)加入HPV16E6-siRNA(0.5μg/ml),mock-siRNA(0.5μg/ml)，48h后收集细胞，用Western Blot和Real-Time qRT-PCR进行分析，并用激光扫描共聚焦免疫荧光显微镜(Laica公司)观察YAP蛋白的定位。

C33A细胞以1×105细胞接种到6孔细胞培养板中，细胞汇合超过85%时，用转染试剂FuGene6(Roche)和pCDNA3.1(+)HPV16E6(1.5μg/ml)混合(操作按照试剂说明书)转染，转染后48h收获细胞，用Western Blot和Real-Time qRT-PCR分析HPV16E6、YAP和CTGF的表达。

1.4Western Blot分析用细胞裂解液(深圳研究生院分子生物学实验室配置)于冰上分别裂解转染Caski细胞和C33A细胞30min，4℃12000×g离心15min。分别取总蛋白10μg，进行Western Blot分析。一抗为鼠抗HPV16E6单克隆抗体(上海研盟生物科技有限公司)(1∶2000)、YAP抗体、抗p-YAP单抗、抗GAPDH单抗，二抗为HRP标记的羊抗鼠抗体(1∶500)。

1.5Real-Time qRT-PCR用总RNA提取试剂盒Trizol分别提取Caski细胞和C33A细胞总RNA，操作按照试剂说明书进行。cDNA合成和PCR扩增用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(MBI Fermentas,St.Leon-Rot,德国)。Real-Time qRT-PCR用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR试剂盒(Finnzymes Oy,Espoo,Finland，芬兰)操作。HPV16E6正向引物序列5′-AATGTTTCAGGACCCTACGG-3′，反向引物5′-TCAGGACACAGTGGCTTTTG-3′；CTGF正向引物5′-CGTGCCGGTGCCCGGACGAG-3′，反向引物5′-GGCCGGGGAGCCGAAGTCAC-3′；β-actin内参正向引物5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′，反向引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。用Real-Time qRT-PCR仪检测SYBR Green荧光值，计算mRNA表达水平，并与β-actin归一化。

2结果

2.1HPV16E6 siRNA对YAP表达的影响HPV16E6 siRNA转染Caski细胞后，用Western Blot分析HPV16E6、YAP和p-YAP的表达。结果HPV16E6的表达明显减少，总YAP的表达变化不明显，然而p-YAP显著增加。见图1。

质粒pCDNA3.1(+) HPV16E6转染C33A细胞后，结果HPV16E6蛋白表达明显，YAP表达明显增加，p-YAP表达明显减少，与未转染质粒C33A细胞和转染阴性质粒C33A细胞比较。见图2。

图1Si-C为阴性对照，GAPDH为内参蛋白。Si-E6为HPV16E6 siRNA转染，E6明显减少，总YAP变化不明显，磷酸化YAP明显增加

图2Lane 1为未行质粒转染，Lane 2和Lane 3为分别转染质粒pCDNA3.1(+)(1.5μg/ml)和pCDNA3.1(+)HPV16E6(1.5μg/ml)。GAPDH为内参蛋白

2.2HPV16E6 siRNA对YAP蛋白细胞定位的影响用激光共聚焦荧光显微镜观察Caski细胞被siRNA敲减HPV16E6后YAP蛋白的定位。Caski细胞阴性对照中，胞浆和胞核内均能见到明显YAP。当HPV16E6被siRNA敲减后，胞核中的YAP明显减少，胞浆中YAP与阴性对照比较无明显变化，见图3(封二)。

2.3HPV16E6 siRNA对YAP直接靶基因CTGF表达的影响YAP-TAZ的直接靶基因为结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor，CTGF)。用HPV16E6siRNA敲减Caski细胞中E6表达后，用Real-Time qRT-PCR检测CTGF的mRNA水平。结果6孔Caski细胞HPV16E6siRNA敲减后CTGF的mRNA初始拷贝数水平为0.25±0.01，未敲除细胞为1.01±0.07，siRNA敲减后mRNA水平显著减少(P<0.01)。6孔C33A细胞转染pCDNA3.1(+)HPV16E6后CTGF的mRNA水平为2.8±0.18，对照细胞mRNA水平为0.92±0.08，转染HPV16E6后CTGF的mRNA水平显著增高(P<0.01)。 Caski细胞与C33A细胞比较，Caski细胞CTGF的mRNA水平显著减少(P<0.01)，见图4。

图4用Real-Time qRT-PCR分析Caski细胞转染HPV16E6siRNA后与C33A细胞转染pCDNA3.1(+)HPV16E6后，CTGF的mRNA水平变化

3讨论

高危型HPV如HPV16、18、31、45等是宫颈癌和其它一些癌症的主要致病源。高危型HPV病毒感染黏膜上皮细胞，常常导致细胞极性的破坏。Martin-BelmonteF等[4]介绍了这些细胞极性蛋白复合物与Hippo信号途径组成的部分反馈环路。

Hippo信号通路是一个进化上高度保守的信号通路，包括YAP,Lasts1/2,Mob,Mst1/2,Sav,Merlin,Ex1/2和Fat4，通过调节细胞增殖、凋亡和干细胞再生来控制器官大小。此外，Hippo信号通路的调节异常将导致癌症发生。Pan D等[5]认为Hippo通路的核心是一个激酶级联反应，Mst1/2(果蝇中Hippo的同源物)激酶和Sav1形成复合物从而磷酸化并激活LATS1/2，LATS1/2激酶磷酸化和抑制转录共激活因子YAP和TAZ，YAP和TAZ是Hippo通路的两个主要下游效应分子。当YAP/TAZ去磷酸化时，它们转运至细胞核内，并与TEAD1-4和其他转录因子相互作用，从而诱导促进细胞增殖和抑制凋亡的基因表达。赵修民等[6]认为YAP是一个致癌基因，许多肿瘤细胞都高表达YAP mRNA。YAP以多种形式存在，末端去磷酸化和磷酸化，分别发挥不同作用。在本实验研究中，用HPV16E6 siRNA转染Caski细胞后，Western Blot检测结果显示Caski细胞内HPV16E6表达减少，YAP表达略有减少，但磷酸化YAP增加。说明E6表达减少后，通过调节Hippo通路，减少YAP表达、增加磷酸化YAP表达，达到抑制肿瘤细胞的作用。用质粒pCDNA3.1(+)HPV16E6转染C33A细胞后，检测结果显示HPV16E6蛋白表达明显时，YAP表达明显增加，p-YAP表达明显减少。说明E6表达增加后，通过调节Hippo通路，增加YAP表达、减少磷酸化YAP，达到促进肿瘤细胞的作用。说明磷酸化YAP抑制肿瘤，去磷酸化YAP促进肿瘤。本实验研究结果进一步证明Pan D[5]和赵修民[6]的观点。同时，进一步说明HPV16E6蛋白与Hippo信号通路以及其下游效应分子YAP具有密切关联性。

赵修民等[6]认为YAP基因是Hippo通路的核心，Mob,Mst1/2,Sav,Merlin,Ex1/，Lasts1/2等转录因子位于YAP上游，为肿瘤抑制因子，通过磷酸化和促进细胞质/细胞核转位对YAP起负性调节作用。Lasts1/2与YAP直接相互作用，能有效抑制YAP。本实验用激光共聚焦免疫荧光显微镜观察，发现阴性对照中，Caski细胞胞浆和胞核内均能见到明显YAP，胞核中含量更高。表明HPV16E6表达不减少或表达较多时，通过调节Hippo信号途径，使胞核中高含量YAP以促进肿瘤细胞。观察Caski细胞被siRNA敲减沉默HPV16E6后，胞核中YAP明显减少，胞浆中存在明显YAP。表明HPV16E6被siRNA敲减沉默后，E6表达减少，通过调节Hippo信号途径，使胞核中YAP明显减少，胞浆中YAP明显具有一定含量，达到共同抑制肿瘤细胞的作用。结合HPV16E6 siRNA转染Caski细胞后YAP表达略有减少、但磷酸化YAP增加，可推知Caski细胞被siRNA敲减沉默 HPV16E6后，胞浆中存在明显YAP即为磷酸化YAP，胞核中为去磷酸化YAP。进一步推知核内去磷酸化YAP具有促发肿瘤的作用，胞浆中磷酸化YAP具有抑制肿瘤作用。更说明HPV16E6蛋白与Hippo信号通路的下游效应分子YAP具有密切关联性。依据Pan D等[5]和赵修民等[6]的观点以及本实验研究结果，推测HPV16E6蛋白可能通过Hippo信号通路作用于Lasts1/2，使其表达下降，负性调节YAP使其增加表达，高表达YAP促进上皮细胞发生肿瘤转化。

结缔组织生长因子(CTGF)为YAP/TAZ的直接靶基因。左钱飞等[7]认为YAP/TAZ是Hippo信号通路下游的主要效应分子，广泛分布于各种组织器官之中。YAP/TAZ与TEAD家族转录因子结合，上调众多生长因子的表达，如CCN家族分泌性蛋白结缔组织生长因子(CTGF)，它是转录共激活子TAZ和转录因子TEAD的下游直接靶基因。CTGF具有促细胞增殖、迁移及分化等作用。本实验用HPV16E6 siRNA敲减Caski细胞中E6的表达后，Caski细胞CTGF的mRNA水平显著减少(P<0.01)。说明Caski细胞中E6的表达减少后，通过Hippo途径使YAP表达减少，YAP/TAZ与TEAD结合量减少，下调CTGF的mRNA，下调CTGF表达水平，减弱Caski肿瘤细胞增殖活性。用能表达HPV16E6的质粒转染C33A细胞后，结果C33A细胞CTGF的mRNA水平表达显著增高(P<0.01)。说明C33A细胞中E6表达增加后，通过Hippo途径让YAP表达增加，YAP/TAZ与TEAD结合增加，上调CTGF，增强C33A肿瘤细胞增殖活性。

总之，本实验结果进一步表明HPV16E6通过作用于Hippo信号途径，调节下游分子YAP让其表达增加，并作用于YAP/TAZ的直接靶基因结缔组织生长因子(CTGF)，上调CTGF，增强肿瘤细胞增殖活性。这可能是HPV16E6通过Hippo途径作用于YAP诱导肿瘤的机制之一。

HPV16E6如何调节Hippo信号通路的上游分子和中游分子来影响下游效应分子YAP，还需要进一步深入研究。高危型HPV病毒感染粘膜上皮细胞，如何导致上皮细胞极性改变与破坏，极性蛋白复合物如何影响调节Hippo信号通路分子，都需要进一步深入研究。

参考文献：

[1]Ghittoni R,Accardi R，Hasan U，et al.The biological properties of E6 and E7 oncoproteins from human papillomaviruses[J].Virus Genes,2010,40(1):1

[2]Liu X,Roberts J,Dakic A,et al.HPV E7 contributes to the telomerase activity of immortalized and tumorigenic cells and augments E6-induced hTERT promoter function[J].Virology,2008,375(2):611

[3]Park HW,Guan KL.The regulation of Hippo pathway and implications for anticancer drug development[J].Trends Pharmacol Sci,2013,34(10):581

[4]Martin-BelmonteF,Perez-MorenoM.Epithelial cell polarity，stem cells and cancer[J].Nature Reviews,Cancer 2011,12(1)：23

[5]Pan D.The hippo signaling pathway in development and cancer[J].Dev Cell,2010,19(4):491

[6]赵修民，王德林.YAP基因表达与肿瘤的关系[J].广东医学，2011，32(12):1628

[7]左钱飞，白艳涛，李佳乐，等，YAP/TAZ对发育和肿瘤的调控及其功能的研究进展[J].现代生物医学进展，2013，13(2):379

The Effect of HPV16E6 Protein on Effector Molecule YAP of the Hippo Pathway

LONG Hong-qing,XIANG Yun,ZHANG Zhen,et al

(DepartmentofOncologyandNuclearMedicine,ClinicalMedicineCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To explore the correlation between the effect of HPV16E6 and the molecular YAP of Hippo pathway. Methods The expression and localization of YAP and its downstream connective tissue growth factor (CTGF) were analyzed by using Western blot,Real-Time qRT-PCR or laser scanning confocal microscope after HPV16E6 overexpression or knockdown in the Caski cell.Results When HPV16E6 was knocked down or over expressed, the corresponding expression of YAP or phosphorylation of YAP decreased or increased. The mRNA expression of CTGF, a YAP downstream molecule, aslo decreased or increased correspondly. The phosphorylation of YAP was mainly localized in the cytoplasm, and the non phosphorylated YAP was mainly localized in the nucleus.Conclusion HPV16E6 induces Hippo pathway deregulation,YAP overexpression and CTGF mRNA expression. HPV16E6 induced disorders of Hippo pathway and increased nuclear YAP expression,which enhanced CTGF expression and promoted the carcinogenicity of HPV16E6.They might promote HPV16E6 pathogenesis,implying that Hippo pathway might be candidate drug target of hr-HPV infection-induced diseases.Hippo pathway may be one of the candidate pathway for the drug treatment of high risk HPV16 infection related diseases

KEY WORDS：Human papillomavirus (HPV);E6 protein;Hippo signal pathway;Yes-associated protein(YAP)

(收稿日期：2015-10-27)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.01.0001

中图分类号：R730.2

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)01-0001-04

*基金项目：湖北省卫生厅科研一般项目(JX6B97)