HPLC 测定雄黄染毒小鼠血浆及肝脏中活性硫的含量

陈　默，苑　洁，霍韬光，张颖花，吴　辉，姜　泓

(中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122)



HPLC 测定雄黄染毒小鼠血浆及肝脏中活性硫的含量

陈默，苑洁，霍韬光，张颖花，吴辉，姜泓*

(中国医科大学公共卫生学院，辽宁沈阳110122)

摘要:建立了HPLC测定雄黄染毒小鼠血浆及肝中活性硫含量的方法．结果表明，该方法准确、灵敏、可靠、检出限低．研究发现，雄黄可引起小鼠血浆、肝中活性硫水平降低．

关键词:高效液相色谱法;雄黄;活性硫

随着对硫化氢( H2S) /活性硫( active sulfur)研究的逐渐深入，人们发现内源性活性硫在机体内的许多生理和病理过程中发挥着重要的作用．目前，活性硫含量的测定常采用顶空气相色谱法［1］、敏感硫电极法［2］和亚甲基蓝分光光度法［3］，然而这些方法的检测灵敏度较低，特异性差，测定结果差异大，不适用于内源性/低水平活性硫含量的测定．而高效液相色谱法( HPLC)是一种具有高分离能力、高灵敏度的分析方法，常用于生物样品中组分的分离与检测．因此，有必要建立HPLC测定生物样品中活性硫含量的方法．另一方面，很多著名的中成药(如安宫牛黄丸、牛黄解毒片、小儿至宝丸等)中含有雄黄( As4S4)，临床上因不规范服用含雄黄中成药而发生的慢性砷中毒事件时有报道［4－5］，(然而此类砷中毒事件中，雄黄是否会通过影响体内H2S/活性硫的水平而产生毒性的相关研究未见报道)．因此，有必要探讨雄黄对血浆、肝脏中活性硫的影响，为进一步阐明雄黄所致药源性毒性作用物质基础的研究及早期预防提供理论依据和实验数据．

1　实验部分

1．1仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国安捷伦公司) ; G1314F紫外检测器，色谱数据工作站; ER-182A全自动电子天平(十万分之一) (日本A＆D公司) ; 3K-18型超速低温冷冻离心机( Sigma公司) ;超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司) ; pH-3c型酸度计(上海精密科学实业有限公司) ; XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司) ; Easypure型纯水系统(美国Barnstead公司)．雄黄(产地，甘肃) ; Na2S标准品( Na2S·9H2O) (＞98%，天津光复精细化工所) ;单溴二胺( MBB，Sigma公司) ;三氟乙酸( TFA，Sigma公司) ;色谱甲醇(天津光复精细化工所) ;色谱乙腈(山东禹王有限公司) ;其他试剂均为分析纯．BCA蛋白定量测定试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)．

1．2实验动物分组及染毒

SPF级雄性ICR小鼠40只(中国医科大学实验动物部提供)，体重( 20±2) g．随机分为4组，每组10只．以0．5%羧甲基纤维素钠( CMC-Na)水溶液为混悬介质，第1组为对照组( 0．5% CMC-Na水溶液)，第2～4组分别灌胃给予雄黄混悬液0．15 g/kg、0．45 g/kg和1．35 g/kg．每日1次，每隔3天称量体重1次，调节灌胃容量，连续灌胃8周．

1．3样品采集及处理

于末次给药24 h后，无水乙醚麻醉，眼眶取血，吸取部分全血4℃下12 000 rpm离心10 min，分离血浆，贮存于－70℃冰箱中待测．断头，取肝脏，预冷0．9%生理盐水冲洗干净，贮存于－70℃冰箱中待用．

1．4色谱条件

色谱柱为Thermo ODS柱( 250 mm×4．6 mm，i．d．，5 μm)，流动相为99．9%的乙腈(含0．1% TFA，A 相)，三氟乙酸缓冲液(含0．1% TFA，B相)，梯度洗脱．流速为0．6 mL/min，检测波长为254 nm，进样量为20 μL．梯度洗脱程序如下: 0～5 min( 15%～35%) ; 5～16 min( 35%～55%) ; 16～18 min( 55%～80%) ; 18～20 min( 80%～15%)．

1．5方法学考察

1．5．1标准曲线与检测限

取对照组的平行混合血浆或肝脏匀浆液(混合Y液) 15 μL，加入15 μL活性硫标准对照液，得相当于浓度为0、3、6、15、30、60 μmol/L的活性硫血浆或肝脏样品，每个浓度分别制备5个平行样本，按1．6项下处理后，进入高效液相色谱仪进行分析，制备标准曲线．以血浆或肝脏样品中活性硫浓度为横坐标，衍生物色谱峰面积为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得直线的回归方程，即为标准曲线．检测限为空白的3倍积分面积．

1．5．2精密度与准确度

取混合血浆及混合Y液15 μL，加入15 μL活性硫标准溶液，得浓度为5、20、40 μmol/L的活性硫质控( QC)样品，每个浓度分别制备5个平行样本，重复3个分析批，连续测定3 d，以当日的标准曲线计算QC样品的测得浓度，与配制的浓度对照，求得方法的准确度与精密度．

1．5．3回收率

取活性硫QC样品，每一浓度进行5个平行样本分析．另取混合Y液15 μL，加入15 μL去离子水，得空白样品，同法测定．方法的回收率=(测得的质控样品浓度—测得的空白样品浓度) /加入的活性硫标准溶液浓度．

1．6血浆及肝脏中活性硫含量的测定

准确称取小鼠的肝脏100 mg，加入1 mL去离子水，超声破碎2 min，混匀，为组织匀浆液．将其分成两部分，分别用于活性硫和蛋白的测定．准确量取上述组织匀浆液30 μL及血浆30 μL，分别加入70 μL Tris-HCl缓冲溶液( pH=9．5)，再加入50 μL MBB衍生化试剂，室温避光反应30 min，加入100 μL SSB溶液沉淀蛋白，4℃下12 000 rpm离心10 min，取上清液，经0．45 μm滤膜过滤，注入HPLC中．

按BCA蛋白定量测定试剂盒说明书中步骤测定各样品中的蛋白浓度．

1．7统计分析

所得数据以平均值±标准差表示，用SPSS 17．0软件单因素方差分析方法( ANOVA)进行各指标组间差异的显著性检验，以P＜0．05作为检验的显著性差异．

2　结果与讨论

2．1方法学考察

2．1．1方法的专属性

图1给出了空白试剂、活性硫标准品、血浆及肝脏经MBB衍生化后典型HPLC色谱图．由图可见活性硫衍生物与其他内源性化合物分离良好，活性硫衍生物的保留时间为13．00 min．

图1　空白( A)、活性硫标准品( B)、血浆( C)和肝脏( D)的HPLC图Fig．1 HPLC graph of Blank ( A)，active sulfur standard ( B)，plasma( C) and liver ( D)

2．1．2标准曲线与检测限

血浆及肝脏样品中活性硫含量的线性回归方程见表1，结果表明活性硫在一定浓度范围内线性关系良好，检出限较低．

表1　活性硫的标准曲线、线性范围、相关系数及检出限( mean±SD，n=10)Table 1　Standard curves，linear ranges，correlation coefficient ( r) and detection limit of active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．1．3方法的精密度、准确度及回收率

由表2可见，血浆和肝脏中活性硫的日内、日间精密度的RSD值分别小于7．1%和6．7%，准确度的RE在－1．5%～－8．6%范围内．该方法中3个浓度的活性硫在血浆及肝脏中的回收率在91．4%～98．5%之间．结果表明，我们建立的HPLC测定小鼠血浆及肝脏中活性硫的分析方法精密度、准确度及回收率良好，符合有关的规范要求．

表2　方法的精密度、准确度和回收率( mean±SD，n= 10)Table 2 Precision，accuracy and recovery of active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．2小鼠血浆及肝脏中活性硫含量

雄黄对小鼠血浆及肝脏中活性硫水平的影响见表3．与对照组相比，雄黄染毒1．35 g/kg组血浆及肝脏中活性硫水平显著降低( P＜0．05)，色谱图中活性硫的MBB衍生化物的峰高、峰面积明显降低，0．15和0．45 g/kg剂量组没有明显的变化( P＞0．05)，色谱峰的峰高、峰面积没有明显变化．结果表明雄黄可使血浆及肝脏中活性硫水平明显降低．

表3　小鼠血浆及肝脏中活性硫水平的测定结果( mean±SD，n= 10)Table 3 Active sulfur contents in plasma and liver of mice ( mean±SD，n= 10)

2．3实验条件的优化

活性硫很难直接被检测，通常需要进行衍生化．MBB是一种荧光衍生化试剂，可以与HS－在碱性条件下进行衍生化反应，生成硫化乙硼烷( sulfide-dibimane，SDB)，SDB是疏水性分子，化学性质稳定，在波长381 nm处具有较强的紫外吸收．试验分别选择254与381 nm作为检测波长，结果显示，在254 nm时的峰面积更大，检测灵敏度更高，且检出限更小，故选用254 nm作为实验的检测波长．因此，我们建立了MBB衍生化-HPLC-紫外检测法，检测灵敏度高于SHEN等［6］所建立的MBB衍生化-HPLC-荧光检测法，并扩大了活性硫的HPLC检测方法的应用范围．此外，与SHEN等［6］相比，保留时间提前约8 min，大大缩短了分析时间，节约分析成本．SHEN等［6］未对方法学进行系统确证和将方法用于应用研究．因此，本研究对方法学进行了系统的研究，结果表明本方法的专属性、灵敏度、精密度、准确度、回收率和稳定性均良好，为方法的实际应用提供了实验依据．

对血浆、肝脏样品中活性硫衍生物的稳定性进行了考察，结果表明在室温放置8 h，经3次冻融循环，－70℃冷冻7 d后稳定性良好．

此外，由于硫易被氧化，实验前所有试剂和容器都经过除氧处理．活性硫可以与玻璃结合，所以实验中我们使用聚乙烯塑料管作为反应器皿．

2．4活性硫、氧化应激与雄黄

随着对H2S/活性硫研究的逐渐深入，人们意识到，内源性H2S在机体内的许多生理和病理过程中发挥着重要的作用．内源性H2S为小分子物质，其在体内分别以1/3的H2S气体分子形式和2/3的硫氢化钠( NaHS，即活性硫)形式存在，两者之间形成一种动态平衡．因此建立准确、高通量的分析方法测定生物样品中H2S/活性硫水平成为研究的重点．

雄黄是国务院在《医疗用药毒性药品管理办法》中特别规定的28种毒性中药之一．雄黄中的砷可被机体吸收进入血及肝脏中［7－8］．目前，氧化应激和氧化损伤学说在慢性砷中毒发病机制的研究中已经得到普遍认可．砷易与含有巯基的分子(如还原型谷胱甘肽和半胱氨酸)结合［9］，并抑制机体一些重要的生化反应，从而产生毒性作用;而巯基能否发挥作用的关键就在于它所处的氧化或还原状态，即处于还原巯基(－SH)或二硫键(－S－S－)状态，活性硫发挥作用则与组织处于还原巯基状态有极大关联;活性硫对多种氧化性物质(如O2－、次氯酸、H2O2等)都有抑制及清除作用，从而减轻氧化应激，具有抗氧化作用［10－12］;我们的实验结果表明，雄黄可引起血及肝脏中活性硫水平降低，但具体机制有待于进一步研究．

3　结论

建立了血浆和肝脏中活性硫的HPLC检测方法，该方法的专属性好，准确度和灵敏度高．利用该方法进行研究表明雄黄可引起小鼠血浆及肝脏中活性硫水平降低．

参考文献:

［1］李英华，吕秀阳，吕丽丽，等．顶空气相色谱法在药物分析中的应用［J ］．药物分析杂志，2005，20( 11) : 1404－1405．

［2］李晓惠，杜军保，唐朝枢．内源性H2S对大鼠高肺血流性肺动脉高压的调节作用［J ］．临床儿科杂志，2006，24( 8) : 674－678．

［3］刘银花，杨汉文，王小同，等．H2S对慢性低氧高二氧化碳模型大鼠学习记忆的影响［J］．中国临床神经科学，2011，19( 2) : 141－145．

［4］马斌，李彤，姜泓．我国雄黄及其复方的毒副作用研究进展［J ］．中华中医药学刊，2013，31( 8) : 1623－1625．

［5］梁爱华，李春英，王金华，等．雄黄的毒性研究［J］．中国中药杂志，2011，36( 14) : 1889－1894．

［6］SHEN X，PATTILLO C B，PARDUE S，et al．Measurement of plasma hydrogen sulfide in vivo and in vitro．Free Radic Biol Med，2011，50( 9) : 1021－31．

［7］苑洁，霍韬光，王艳蕾，等．HG-FAAS法测定雄黄染毒小鼠肝及肾脏中的砷含量［J ］．化学研究，2014，25 ( 1) : 82－85．

［8］张颖花，高咏，霍韬光，等．利用氢化物发生-冷阱捕集-原子吸收光谱联用技术测定雄黄染毒大鼠血中砷的含量［J］．化学研究，2013，24( 3) : 274－276．

［9］姜泓，丁敬华，高双，等．As(Ⅲ)和As(Ⅴ)与牛血清白蛋白的结合平衡研究［J ］．化学研究，2008，19 ( 2) : 91－93．

［10］孙燕，金红芳，魏红玲，等．巯基修饰剂对硫化氢的离体心脏灌流效应的影响［J ］．中国药理学通报，2009，25( 4) : 469－473．

［11 ］KIMURA Y，KIMURA H．Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stress ［J］．FASEB J，2004，18: 1165－1167．

［12 ］KIMURA Y，DARGUSCH R，SCHUBURT D，et al．Hydrogen sulfide protects HT22 neuronal cells from oxidative stress［J ］．Antioxid Redox Signal，2006，8: 661－670．

［责任编辑:吴文鹏］

Determination of active sulfur in plasma and liver of mice exposed to realgar by HPLC

CHEN Mo，YUAN Jie，HOU Taoguang，ZHANG Yinghua，WU Hui，JIANG Hong*

( School of Public Health，China Medical University，Shenyang 110122，Liaoning，China)

Abstract:A method of HPLC was established to detect the contents of active sulfur in plasma and liver of mice．The method is accurate，sensitive，reliable and low detection limit．It is found that realgar can reduce active sulfur levels in plasma and liver of mice．

Keywords:high performance liquid chromatography; realgar; active sulfur

作者简介:陈默( 1991－)，女，硕士生，研究方向为中药毒/药效物质基础研究．*通讯联系人，E-mail: jianghong@ mail．cmu．edu．cn．

基金项目:国家自然科学基金( 81473417，81403066)．

收稿日期:2015－10－09．

中图分类号:O657．7

文献标志码:A

文章编号:1008－1011( 2016) 01－0081－04