雌激素受体β通过非激素配体途径减轻β淀粉样蛋白对PC12细胞的毒性作用

李　娜，蒋志宏，代　玥，马　强

(大连大学附属中山医院 神经内科，辽宁 大连116001)



雌激素受体β通过非激素配体途径减轻β淀粉样蛋白对PC12细胞的毒性作用

李娜，蒋志宏，代玥，马强*

(大连大学附属中山医院 神经内科，辽宁 大连116001)

摘要：目的研究在无雌激素作用下雌激素受体β过表达对PC12细胞在β淀粉样蛋白刺激下抗炎、抗凋亡能力的影响。方法取普通PC12细胞为对照组，Ad-EGFP空白质粒转染的PC12细胞为空白组，Ad-ERβ-EGFP转染的PC12细胞为转染组，western blot法检测3组中ERβ蛋白的表达。随机选取未感染的PC12细胞为对照组，转染ERβ后的PC12细胞分为过表达组和ABI-2组，3组均加入培养液及Aβ，ABI-2组还加入Akt特异性抑制物ABI-2。实时定量PCR法测定3组在β淀粉样蛋白刺激作用下炎症因子TNF-α和IL-1β mRNA的表达；流式细胞术测定3组在β淀粉样蛋白刺激作用下的凋亡情况。结果ERβ在转染后PC12细胞内高表达。过表达组TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表达明显低于对照组及ABI-2组。过表达组PC12细胞凋亡率明显低于对照组及ABI-2组。结论ERβ在不依赖雌激素受体的情况下，通过Akt途径发挥其抗炎、抗凋亡及减轻Aβ细胞毒性的作用。

关键词：雌激素；雌激素受体；阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白；PPAR-γ

(ChinJLabDiagn,2016,20:0198)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病机制尚未完全清楚，临床缺乏有效的药物治疗。与男性相比，女性在80-85岁后AD的发病率明显增加，因此认为雌激素在AD的发生、发展中起到了重要的作用[1]。研究表明，雌激素可通过与神经细胞膜表面或核雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合，发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡能力，并拮抗β淀粉样蛋白的毒性作用，从而延缓AD的病程[2]。但雌激素替代性治疗可大大绝经后女性增加患乳腺癌及子宫内膜癌的风险，因而限制了其用于治疗AD的临床价值。

ER主要包括α和β两种亚型，除了经典的雌激素-雌激素受体途径，ERβ在无雌激素结合情况下以不依赖配体的形式激活胞内通路，进而发挥生物学作用[3]。因此，在不应用有潜在致癌风险的雌激素的情况下，是否可以通过单纯调控ERβ表达发挥其对AD的神经保护作用呢？本研究利用腺病毒(adenovirus,Ad)为载体，将ERβ基因导入PC12细胞并使其在PC12细胞中过表达。并以普通PC12细胞为对照，研究在无雌激素作用下ERβ过表达对PC12细胞在β淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)刺激下抗炎、抗凋亡能力的影响。

1材料与方法

1.1主要实验器材与试剂

腺病毒基因载体Ad-ERβ-EGFP由吉凯基因化学技术有限公司(上海)代为构建。BSA、TBST购自博士徳公司(武汉，中国)。ERβ一抗IgG和二抗IGM均购自santa cruz公司。Superscript III Reverse Transcriptase试剂盒购自Invitrogen公司。PCR试剂盒购自北京Transgene生物技术有限公司。TNF-α和IL-1β mRNA特异性引物由上海生物工程研究所合成。AnnexinV-FITC、PropidiumIodide购自南京凯基生物科技发展有限公司。Calibur流式细胞仪购自BD公司。

1.2实验方法

1.2.1Ad-ERβ-EGFP转染PC12细胞将PC12细胞制成单细胞悬液，加入24孔板(2×105/孔)中。以5×107，1×108，5×108，1×1094个不同滴度将Ad-ERβ-EGFP病毒加入孔中，然后将细胞放入37℃，含5 % CO2的细胞培养箱内孵育48 h，在不同时间点于荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光表达情况。利用同样方法构建Ad-EGFP空白质粒转染PC12细胞。通过显微镜下观察挑选绿色荧光表达最强的细胞，消化后进一步扩增培养。

1.2.2Western blot检测PC12细胞中ERβ的表达取普通PC12细胞为对照(Control)组，Ad-EGFP空白质粒转染的PC12细胞为Vector组，Ad-ERβ-EGFP转染的PC12细胞为ERβ组，检测3组中ERβ蛋白的表达，其具体过程如下：RIPA裂解液提取细胞总蛋白，采取BCA法测定总蛋白浓度。总蛋白行10% SDS-PAGE不连续凝胶电泳，湿法电转膜，BSA封闭2 h，TBST洗脱后加一抗 1∶1 000于4度孵育过夜，TBST洗脱，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2 h后行ECL化学发光法显示结果。

1.2.3构建AD细胞模型并分组随机选取未感染的PC12细胞为 Model组，加入培养液以及Aβ至终浓度为20 μM。随机选取转染ERβ后的PC12细胞分为Aβ组和ABI-2组，ERβ组中加入培养液及Aβ至终浓度为20 μM；ABI-2组中除培养液和Aβ外，还加入Akt特异性抑制物ABI-2至终浓度20 μM。将3组细胞放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h后待测。

1.2.4实时定量PCR取3组细胞悬液离心(5 min，800 g)后彻底弃上清，按照说明书方法通过Trizol提取总RNA，使用Superscript III Reverse Transcriptase试剂盒进行cDNA合成。将2.5 μl合成的cDNA、1 μl特异性引物与TransStartTM SYBR Green qPCR Supermix充分混合后，在ABI 7500 PCR仪上进行实时定量PCR测定，以GAPDH mRNA内参，定量产物浓度。

1.2.5检测PC12细胞凋亡取3组PC12细胞，通过PI和Annexin V-FITC测定凋亡率，具体步骤如下：将待测细胞制成单细胞悬液，每个样品加入5 μl AnnexinV-FITC，混匀后避光4摄氏度下孵育30 min，再加入5 μl PropidiumIodide(PI)，充分混匀，室温下避光反应15 min，使用BD流式细胞仪进行测定，Annexin V表达阳性的细胞为凋亡细胞。

1.3统计学分析

使用SPSS 17.0软件进行数据处理。计量资料均用平均值±标准差表示，分组资料以相对数表示。组间比较采用方差分析及q检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1Ad-ERβ-GFAP可有效转染PC12细胞

由左至右分别为病毒滴度为5×107，1×108，5×108，1×109时转染的PC12细胞。

图1Ad-ERβ-GFAP质粒转染PC12细胞

PC12细胞经腺病毒转染24 h后即出现荧光表达，48 h后表达最强，病毒浓度梯度不同，表达效果不一样。PC12细胞荧光表达量随病毒浓度增高而增加，病毒浓度为5×108/孔时荧光表达达到顶峰，病毒浓度为1×109/孔时荧光表达量并无明显增加，因此选取5×108/孔时感染的PC12行进一步实验 (如图1)。

2.2ERβ在转染后PC12细胞内高表达

Western blot结果显示：ERβ蛋白在各组PC12细胞内均有表达，其中转染组ERβ蛋白含量明显高于对照组与空白组(P<0.01)；与对照组及空白组相比， ERβ蛋白表达无明显差异(P>0.05)，见图2。表明ERβ基因可成功导入PC12细胞中并过表达，空白Ad质粒对PC12细胞ERβ表达无影响。

图2PC12细胞中ERβ的表达 可见转染组ERβ表达显著高于对照组和空白组(*P<0.01 vs 空白组，**P<0.01 vs 对照组)；空白组和对照组ERβ表达无明显差异。

2.3过表达ERβ减轻Aβ对PC12细胞的致炎作用

实时定量PCR结果发现：过表达组TNF-α mRNA表达明显低于对照组(P<0.01)，低于ABI-2组(P<0.05)；过表达组IL-1β mRNA含量低于对照组(P<0.05)，低于ABI-2组(P<0.05)，具体数值见表1。

表1　PC12细胞中TNF-α mRNA和IL-1 mRNA表达量

可见转染组PC12细胞中TNF-α mRNA表达明显低于对照组(*P<0.01)，低于ABI-2组(**P<0.01)；转染组PC12细胞中IL-1 mRNA表达低于对照组和ABI-2组(*P<0.05，**P<0.05)

2.4过表达ERβ减轻Aβ对PC12细胞的凋亡作用

经Annexin V/PI标记法流式细胞术对对照组、过表达组和ABI-2组3组PC12细胞检测发现，过表达组PC12细胞凋亡率为 (11.27±2.14)%，明显低于对照组(21.14±4.13)%(P<0.01)，低于ABI-2组(15.33±4.21)%(P<0.05)，见图3。

由左向右分别代表对照组、过表达组和ABI-2组中凋亡细胞百分比，结果可见过表达组PC12细胞凋亡率明显低于对照组，低于ABI-2组。

3讨论

腺病毒载体可以转染不同类型的真核细胞，不受靶细胞是否为分裂细胞的限制，且转基因效率高，体外实验转染效率通常接近100%，容易制得高滴度病毒载体。另外，Ad进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，安全性高[4]。本实验发现，ERβ在普通PC12细胞中表达量极低，ERβ基因可被有效转导入PC12细胞并在细胞中过表达。且通过与对比普通PC12细胞相比发现，空白Ad载体转染PC12对细胞中ERβ的表达并无影响，可以用于进一步实验。

AD的病理特征为神经元数量减少、细胞内神经原纤维缠结和细胞外β样淀粉蛋白沉积，因此认为β样淀粉蛋白是诱导AD的发生、发展的重要致病物质[5,6]。Aβ可刺激小胶质细胞释放炎症因子，诱发氧化应激，损害胆碱能神经以及诱导凋亡。本研究利用实时定量PCR检测发现，在加入Aβ后，PC12细胞中重要炎症因子TNF-α和IL-1β表达量明显增加，且通过流式细胞仪发现PC12细胞的凋亡率也明显增加，验证了Aβ对细胞的毒性作用。通过与普通PC12细胞的对比，转染ERβ的PC12细胞在无雌激素的环境下，细胞内炎症因子的表达明显减少，且凋亡率也有所下降，说明ERβ可以通过非结合雌激素的方式减轻Aβ对细胞的毒性以及抗凋亡作用。

Akt又被称为蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，是一种分子量约为 60 kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶，处于多条信号通路的重要交叉点，具有调节细胞生长、分化及凋亡的关键作用[7]。通过对AD患者额叶及颞叶标本检测发现，Akt的活性和磷酸化浓度明显降低，并有研究发现激活Akt途径能在体外减轻Aβ对细胞的毒性作用[8]。另外，当雌激素受体与配体结合后，可通过Akt途径发挥生物学作用[9]，但尚无ERβ是否可以以非配体依赖方式与Akt途径相互作用的报道。本研究在无雌激素存在的情况下，向转染ERβ的PC12细胞中加入Akt的特异性抑制物API-2后发现，ERβ的抗炎、抗凋亡能力受到抑制。结果充分说明了ERβ在不依赖雌激素受体的情况下，是通过Akt途径发挥其抗炎、抗凋亡及减轻Aβ细胞毒性的作用。是否还有别的途径参与ERβ的非配体依赖，还需要进一步研究。

参考文献：

[1]Blanc F,Poisbeau P,Sellal F,et al.[Alzheimer disease,memory and estrogen][J].Rev Neurol (Paris),2010,166(4):377.

[2]Bozzo C,Graziola F,Chiocchetti A,et al.Estrogen and beta-amyloid toxicity:role of integrin and PI3-K[J].Mol Cell Neurosci,2010,45(2):85.

[3]Maneix L,Antonson P,Humire P,et al.Estrogen receptor beta exon 3-deleted mouse:The importance of non-ERE pathways in ERbeta signaling[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2015,112(16):5135.

[4]Eto Y,Yoshioka Y,Asavatanabodee R,et al.[Development of pegylated adenovirus vector for cancer gene therapy][J].Yakugaku Zasshi,2008,128(12):1733.

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[7]Hers I,Vincent EE,and Tavare JM.Akt signalling in health and disease[J].Cell Signal,2011,23(10):1515.

[8]Yin G,Li LY,Qu M,et al.Upregulation of AKT attenuates amyloid-beta-induced cell apoptosis[J].J Alzheimers Dis,2011,25(2):337.

[9]Jesmin S,Mowa CN,Sultana SN,et al.Estrogen receptor alpha and beta are both involved in the cerebral VEGF/Akt/NO pathway and cerebral angiogenesis in female mice[J].Biomed Res,2010,31(6):337.

Estrogen receptor β attenuates the toxicity in PC12 cells induced by β-amyloid via estrogen independent pathwayLINa,JIANGZhi-hong,DAIYue,etal.(TheAffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian116001,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of estrogen receptor beta on beta amyloid induced inflammation and apoptosis in PC12 cells without estrogen stimulus.MethodsPC12 cells were divided into control group,blank group,and Ad-ERβ-EGFP group,treatment with PBS,blank vector and Ad-ERβ-EGFP,respectively.Western blot was used to detect ER beta protein expression in three groups.Uninfected PC12 cells were randomly selected as control group.After transfection of ERβ,PC12 cells were divided into Over-expression group and ABI-2 group.All 3 groups were treated with Aβ,whereas ABI-2 group was also added with Akt specific inhibitor ABI-2.Real time quantitative PCR was used to detect TNF-α and IL-1β mRNA expression.Flow cytometry was used to apoptosis.ResultsERβ over-expressed in PC12 cells after transfection.TNF-α and IL-1β mRNA expression in over-expression group were significantly lower than those of the control group and ABI-2 groups.Apoptosis of PC12 cells in over-expression group was obviously lower than those of the control group and ABI-2 group.ConclusionInependent of estrogen,ERβ could represent anti-inflammatory and anti apoptotic effects and thus reduce the toxic effects of Aβ via Akt pathway.

Key words:estrogen;Estrogen receptor;Alzheimer's disease;Amyloid beta;PPAR-gamma

(收稿日期：2015-03-12)

文献标识码：A

中图分类号：R741.02；Q816

文章编号：1007-4287(2016)02-0198-04

*通讯作者