体外膜肺氧合对撞击伤致急性肺损伤相关分子通路影响

史秀云，　张玉彪，　柳云恩，　佟昌慈，　刘学磊，　施　琳，　刘　颖，　丛培芳，

金红旭1,2，　高　燕1,2，　侯明晓1,2

沈阳军区总医院　1.急诊科；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及辽宁省重症创伤和

器官保护重点实验室，辽宁 沈阳　110016；



体外膜肺氧合对撞击伤致急性肺损伤相关分子通路影响

史秀云1,2，张玉彪1,2，柳云恩1,2，佟昌慈1,2，刘学磊1,2，施琳1,2，刘颖1,2，丛培芳1,2，

金红旭1,2，高燕1,2，侯明晓1,2

沈阳军区总医院1.急诊科；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及辽宁省重症创伤和

器官保护重点实验室，辽宁 沈阳110016；

摘要：目的探讨体外膜肺氧合(ECMO)对实验犬重症创伤导致的急性肺损伤的治疗效果。方法选取20只实验犬，随机分为对照组(A组)，模型组(B组)，机械通气治疗组(C组)，ECMO治疗组(D组)。将4组实验犬在无菌条件下取出肺组织，分别用于Western Blot、实时荧光定量PCR和病理学检测。结果B组实验犬的促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6的表达均升高，经过机械性通气和ECMO治疗后，促炎因子的表达量均下降(P<0.05)，炎症相关通路因子NF-κB的表达量也明显降低，说明重症创伤导致的急性肺损伤引起的炎症反应机制可能与NF-κB通路有关；凋亡因子Caspase3的表达无明显差异(P>0.01)；Bax在A组中表达较低，在创伤后表达明显增高，治疗无效果。抑制凋亡因子Bcl-2在A组中表达较高，在B组表达量降低，经保护性肺通气和ECMO治疗后表达量相对增高。结论实验犬经过ECMO治疗可改善重症创伤导致急性肺损伤。

关键词：体外膜肺氧合(ECMO)；急性肺损伤；炎症因子；NF-κB信号通路；急危重症

体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)是一种将体内部分静脉血引流到体外，由驱动泵将体外经ECMO后变为的动脉血液泵入体内的一种心肺辅助技术。ECMO作为一种体外生命支持方式，其本质是一种改良的人工心肺机，最重要的部分是血泵和膜肺，分别起人工心和人工肺的作用，为呼吸衰竭和循环衰竭患者提供更长时间的生命支持[1-2]。当患者的肺功能严重受损、治疗无效时，ECMO可以代替肺行使气体交换的功能[3]，为患者的治疗与康复提供更多的时间。另外，当患者的心功能严重受损时，ECMO也可以代替心脏泵血功能，维持血液循环[4]。

当机体发生急性肺损伤(acute lung injury，ALI)时，肺脏在行使通气和换气功能的同时，机体通过自身体内各种防御机制来减轻有害因子对肺脏的侵害，促使肺脏恢复肺功能；而随着现代医学的发展，通过人为的干预可以减少有害因素对肺脏的损伤[5]，肺功能的恢复过程需要一定的时间，如在这段时间内，有其他设备能代替损伤的肺工作，使其充分“休息”，也许对肺功能的恢复有一定的帮助，ECMO正是一种起代替肺行使肺功能作用的一种设备[6-7]。

本研究通过构建立犬的撞击伤致急性肺损伤的动物模型，应用Western blot、实时荧光定量PCR技术和病理学观察，探讨多种重症创伤导致急性肺损伤中，传统机械通气治疗和经ECMO治疗的区别，为临床ECMO救治ALI提供理论基础，提高救治成功率。现报道如下。

1资料与方法

1.1实验动物及分组20只成年健康Beagle犬，体质量30～34 kg，随机分为4组：对照组(A组，n=5)；模型组(B组，n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型；机械通气组(C组，n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型，采用机械通气治疗；ECMO治疗组(D组，n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型，采用ECMO治疗。所有实验犬均购自于沈阳军区总医院动物实验中心，在沈阳军区总医院动物实验中心饲养，食物及水由动物实验中心提供。

1.2犬肺损伤模型建立实验犬标准喂养2周，术前12 h禁食不禁水，固定于实验架上，常温条件下18.4 mm橡皮弹5 m距离致胸部创伤。橡皮弹全弹重18.47～19.23 g，飞行弹重8.31～8.72 g，弹丸最大直径18.16～18.83 mm，弹速106～125 m/s，动能(E)为59.73 J，比动能(Es)为21.69 J/cm2。

1.3机械通气治疗实验犬30 mg/kg戊巴比妥钠静脉注射，麻醉后固定，仰卧在手术台上。F6.0～F8.0气管导管插入并连接呼吸机，呼吸频率15次/min，FiO2为40%，氧浓度1.00%，潮气量20 ml/kg。游离右侧股动脉，采集动脉血标本，肝素化置管后连接多道生理信号采集处理系统。游离左侧股静脉，置管连接三通，连接输液装置。气管插管和Y型管之间连接双向流量压力传感装置，连接多道生理信号采集处理系统，测量气道压力和流量的改变。在整个实验过程中注意麻醉深度，适时适量追加戊巴比妥钠， 0.03%的司可林维持实验犬肌松，自主呼吸消失为准。

1.4ECMO治疗术前以1 mg阿托品腹腔注射，30 mg/kg戊巴比妥钠静脉注射麻醉实验犬至睫反射消失，固定于手术台上。F6.0～F8.0气管插管，连接简易呼吸器、氧气罐和氮气罐，维持实验犬的呼吸，调节氮气、氧气的浓度比以降低吸入的氧气浓度，将置入的热稀释导管与有创动脉血氧饱和度监测仪和多功能监护仪连结。游离双侧股动脉、股静脉及右侧颈静脉，采用股静脉-颈静脉ECMO模式，实验犬的股静脉插管和颈内静脉插管与ECMO系统相连，按右股静脉、储血器、滚压泵、氧合器、右颈内静脉的顺序连接。激活全血凝固时间(ACT)维持在140～200 s。体外循环开始时，膜肺气血比调至1∶1，氧合器清扫气流为纯氧，流量2～4 L/min。从心排量所能达到的最大值为体外循环血量开始，转流建立后，给予无氧呼吸(全氮气)。维持动脉血氧饱和度(SaO2)在90%时的体外循环血流量。

1.5肺组织标本采集依据《善待实验动物的相关措施》的方法处死实验犬，无菌条件下取出肺组织。取部分肺上叶置入EP管中，置入液氮罐中，并保存于-80 ℃冰箱待用。

1.6检测方法

1.6.1总蛋白提取及定量方法将冻存在液氮中的肺组织取出后融化，加入RIPA裂解液后制备成组织匀浆，取上层蛋白溶液，测定其蛋白的浓度，-80 ℃冻存备用。

1.6.2Western blot方法配制10%聚丙烯酰胺凝胶，经过电泳、转膜，加入一抗GADPH(Santa)、IL-1b(Abcam)、IL-4(Abcam)、IL-6(Abcam)、IL-10(Abcam)、TNF-α(Abcam)、NF-kB(Abcam)、Caspase3(Santa)、Bax(Santa)、Bcl-2(Santa)4°C杂交过夜，二抗孵育，增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)，凝胶成像系统采集图像。

1.6.3肺组织RNA的提取及cDNA的合成方法取适量的组织移入研钵中，加入液氮将组织研碎，其余步骤按Trizol试剂操作说明书进行。RNA沉淀干燥后，加入DEPC水溶解。根据cDNA Kit说明书，反转录生成第一链cDNA。

1.6.4Real Time-PCR检测方法应用SYBR Green实时荧光定量PCR法，以GAPDH为参比基因，对GADPH、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、NF-кB、Caspase3、Bax、Bcl-2进行实时荧光定量分析，计算各目的基因/内参基因的相对定量。见表1。

表1　各基因引物序列

1.6.5病理学检测方法取出经10%甲醛固定的肺组织标本，石蜡包埋并制作切片，进行HE染色，光镜下观察肺组织结构的变化。

2结果

2.1Western blot检测结果通过Western blot实验检测，结果显示4种炎症相关因子IL-1b、IL-4、IL-6和IL-10在B组表达量均明显高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；经治疗后，C组保护性肺通气治疗和D组ECMO治疗中其表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。肿瘤坏死因子TNF-α的表达量无明显变化。检测炎症相关通路因子NF-κB结果显示，B组表达量明显高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)；C组保护性肺通气治疗和D组ECMO治疗经治疗后表达量明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。检测凋亡相关因子结果显示，凋亡因子Caspase3的表达无明显差异，而Bax在A组中表达较低，在创伤后表达有所增高。抑制凋亡因子Bcl-2在A组中表达较高，在B组表达量降低，经保护性肺通气和ECMO治疗后表达量相对增高。见图1。

图1　4组实验犬肺组织中相关蛋白表达

2.2mRNA检测结果通过Real Time PCR实验检测，结果显示炎症相关因子IL-1b、IL-4、IL-6和IL-10的表达水平与Western blot结果相一致。B组模型组表达量明显高于A组对照组，C组保护性肺通气治疗和D组ECMO治疗经治疗后4种炎症相关因子表达量明显降低。促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6和抑制炎症因子IL-10创伤后表达升高。肿瘤坏死因子TNF-α的表达量无明显变化。B组模型组NF-κB表达量明显高于A组对照组，C组保护性肺通气治疗和D组ECMO治疗经治疗后表达量明显降低。凋亡因子Caspase3的表达无明显差异，Bax在A组对照组中表达较低，在创伤后表达明显增高。抑制凋亡因子Bcl-2在A组对照组中表达较高，在B组模型组表达量降低，经保护性肺通气和ECMO治疗后表达量相对增高。见表2。

2.3组织学观察结果HE染色下，A组肺组织结构正常，肺泡壁未见损伤；B组肺组织结构明显破坏，肺泡壁可见明显的损伤，有淤血，可见明显的红细胞浸润；C组保护性肺通气治疗后，肺组织结构破坏程度轻度缓解，淤血和红细胞浸润较B组轻但仍然严重；D组ECMO治疗后，肺组织结构破坏程度明显减轻，轻度红细胞渗出。

表2　mRNA Real Time PCR相对表达量

注：与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05

3讨论

ALI是一种全身炎症反应综合征，易转为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，最终可能发展成多器官障碍综合征(MODS)。到目前为止，ALI及ARDS的发病机制尚不明确，尚无明确的治疗方法[8-9]。ALI的病理变化主要为肺组织微血管通透性增高，炎症细胞浸润，并伴有肺间质纤维化，肺水肿；其病理生理学的变化主要为肺通气和肺换气功能受损[10-11]。传统的治疗方法为机械性通气，但其治疗效果欠佳。

20世纪60年代初，ECMO被用于体外循环以来，主要应用于心、肺功能的支持治疗,改善低氧血症。二十世纪七十年代初，Hill等[12]应用 ECMO成功救治ALI患者。1975年，美国国立卫生研究院(NIH)评估ECMO治疗成人ALI的疗效，由于该研究的设计和管理存在问题，研究结果很不理想[13]。因此，关于ECMO治疗ALI的研究一度被中断。但之后有研究人员发现ECMO治疗ALI的有价值的报道[14-15]。1993年，北京阜外医院龙村等[16]用ECMO 成功救治了ALI患者。Hemmila等[17]对1989-2003年使用ECMO治疗的ALI患者进行分析，结果显示，其实际生存率远高于预期生存率。2009年，Peek等[18-19]研究ECMO治疗成人ALI，患者的存活率与机械性通气相比明显提高10个百分点。本研究通过建立实验犬肺损伤的模型，利用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR、病理学染色等技术探讨传统的机械性肺通气和ECMO治疗组之间的区别。研究发现，Western blot实验中，模型组的促炎因子IL-1b、IL-4、IL-6创伤后表达升高，经过治疗后表达有所改善说明ECMO治疗可以改善重症创伤导致的急性肺损伤引起的炎症反应，但抑制炎症因子IL-10的表达趋势与促炎因子相同的原因需要进一步的研究验证。C组保护性肺通气治疗和D组ECMO治疗后，NF-kB的表达量明显降低，说明重症创伤导致的急性肺损伤引起的炎症反应机制可能与NF-kB通路相关。凋亡因子Caspase3和Bax治疗前后表达差异不明显，而抑制凋亡因子Bcl-2在A组对照组中表达较高，在B组模型组表达量降低，经治疗后表达量显著增高，说明ECMO治疗对重症创伤导致肺细胞凋亡的保护作用可能和Bcl-2通路有关。实时荧光定量PCR结果与Western blot结果基本相同，更进一步的从基因表达的水平上确证了ECMO治疗对重症创伤导致急性肺损伤的保护作用。病理学检查中，肺大体观察发现，模型组肺挫裂伤，可见明显的淤血，经保护性肺通气治疗和ECMO治疗后，肺部损伤、肋骨骨折、肺挫裂伤、血气胸和淤血均明显缓和；HE染色发现，模型组肺组织结构破坏，红细胞浸润，在经过保护性肺通气治疗和ECMO治疗后淤血和红细胞浸润均较模型组轻，但和正常对照组相比较仍然较严重，这些结果表明经过ECMO治疗可改善重症创伤导致的实验犬急性肺损伤。

参考文献

[1]Ohno T,Fukino S,Ota R,et al.Lung Cancer Treated with Wedge Resection of the Lower Lobe of the Left Lung with the Assistance ofExtracorporeal Membrane Oxygenation(ECMO) after Right Pneumonectomy[J].KyobuGeka,2015,68(5):334-338.

[2]Unai S,Tanaka D,Ruggiero N,et al.Acute Myocardial Infarction Complicated by Cardiogenic Shock:An Algorithm-Based Extracorporeal Membrane Oxygenation Program Can Improve Clinical Outcomes[J].Artif Organs,2015.

[3]Zhu F.The The practice of the “ultra” protective lung ventilation strategy:combined ventilation mode of extracorporeal membrane oxygenation and high frequency oscillatory ventilation[J].ZhonghuaJie He HeHuXi,2014,37(11):845-848.

[4]Zwischenberger JB,Steinhorm RB,BartletlRH,et al.ECMO extracorporeal cardiopulmonary support in critical care[M].2nd ed.Ann Arbor:Extracorporeal life support organization,2000:295-590.

[5]Lehr CJ,Zaas DW,Cheifelz IM,et al.Ambulatory extracorporeal membrane oxygenation as a bridge to lung transplantation:walking while waiting[J].Chest,2015,147(5):1213-1218.

[6]Thomas Müller,Alois Philipp,AndreasLuchner,et al.A new miniaturized system for extracorporeal membrane oxygenation in adult respiratory failure[J].Crit Care,2009,13(6):R205.

[7]Wu SC,Chen WT,Lin HH,et al.Use of extracorporeal membrane oxygenation in severe traumatic lung injury with respiratory failure[J].Am J Emerg Med,2015,33(5):658-662.

[8]施卉,任成山.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征基础及临床研究进展[J].中华肺部疾病杂志,2013,6(4):350-355.

[9]刘伟,金发光.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的治疗新进展[J].中华肺部疾病杂志,2013,6(1):61-64.

[10]Dalton HJ,Macrae DJ.Pediatric Acute Lung Injury Consensus Conference Group.Extracorporeal support in children with pediatric acute respiratory distress syndrome:proceedings from the Pediatric Acute Lung Injury Consensus Conference[J].PediatrCrit Care Med,2015,16(5 Suppl 1):S111-S117.

[11]Gordon C,Koerner MM,Foy A,et al.Insertion of the avalon cannula for venovenous extracorporeal membrane oxygenation in a patient with an implanted ASD occlusion device [J].Heart Surq Forum,2015,18(1):31-32.

[12]Hill JD,O′Brien TG,Murray JJ,et al.Prolonged extracorporeal oxygenation for acute post-traumatic respiratory failure (shock-lung syndrome).Use of the Bramson membrane lung[J].N Engl J Med,1972,286(12):629-634.

[13]Browide DA,Deane R,Shinozaki T,et al.Adult respiratory distress syndrome (ARDS) sepsis and extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) [J].J Trauma,1977,17(8):579-586.

[14]Zwischenberger BA,Clemson LA,Zwjschenberger JB,et al.Artificial lung:progress and prototypes [J].Expert Rev Med Devices,2006,3(4):485-497.

[15]Morris AH,Wallace CJ,Menlove RE,et al.Randomized clinical trial of pressure -controlled inverse ratio ventilation and extracorporeal CO2removal for adult respiratory distress syndrome[J].Am J RespirCrit Care Med,1994,149(2Pt1):295-305.

[16]龙村,胡宝琏.体外循环膜肺支持疗法:(附一例临床报告)[J].中国循环杂志,1993,8(8):487- 489.

[17]Hemmila MR,Rowe SA,Boules TN,et al.Extracorporeal life support for severe acute respiratory distress syndrome in adults[J].Ann Surg,2004,240(4):595-605.

[18]Peek GJ,Moore HM,Moore N,et al.Extracorporeal membrane oxygenation for adult respiratory failure[J].Chest,1997,l12(3):759-764.

[19]Peek GJ,Mugford M,Tiruvoipati R,et al.Efficacy and economic assessment of conventional ventilator support versus extracorporeal membrane oxygenation for severe adult respiratory failure (CESAR):a multicentrerandmised controlled trial[J].Lancet,2009,374(9698):1351-1363.

·论著·

第一作者：史秀云(1991-)，女，辽宁铁岭人，技师，硕士

Molecular mechanism of extracorporeal membrane oxygenation on the expression of cytokines in acute lung injury induced by impact injury

SHI Xiu-yun,ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,TONG Chang-ci,LIU Xue-lie,SHI Lin,CONG Pei-fang,LIU Ying,JIN Hong-xu,GAO Yan,HOU Ming-xiao(Department of Emergency Medicine,and Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) on acute lung injury.MethodsForty dogs were randomly divided into four groups:Group A,the control group;Group B,acute lung injury group;Group C:mechanical ventilation group;Group D:ECMO group.The lungs were removed under the aseptic condition from dogs of the four groups,and Western blot,Real-Time PCR,Pathological changes of lung tissue for HE staining were observed.ResultsPro-inflammatory cytokines of IL-1b,IL-4,IL-6 in Group B increased when compared with those in Group A.After mechanical ventilation and ECMO treatment,pro-inflammatory cytokines decreased(P<0.05).Inflammatory pathways factor NF-κB expression also significantly decreased.Description of acute lung injury caused by inflammation might be associated with NF-κBpathway.There were no statistically significant difference among Caspase3,Bax and Bcl-2(P>0.01).ConclusionECMO can improve lung function effectively on acute lung injury.

Key words:Extracorporeal membrane oxygenation;Acute lung injury;Inflammatory cytokines;NF-κB pathway;Emergency and severe disease

收稿日期：2015-08-30

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.01.03

文章编号：2095-5561(2016)01-0010-05

中图分类号：TH 777

文献标志码：A

通信作者：侯明晓，E-mail:houmingxiao188@163.com

基金项目：2012年辽宁省科技攻关 (201122007)；2012年全军“十二五”面上项目(CSY12J002)；2013年全军“十二五”面上延续项目(CSY13J003)