体外膜肺氧合对撞击伤致急性肺损伤细胞因子表达影响

佟昌慈，　柳云恩，　张玉彪，　施　琳，　刘　颖，　刘学磊，　丛培芳，

金红旭1,2，　高　燕1,2，　侯明晓1,2

沈阳军区总医院　1.急诊科；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及

辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳　110016



体外膜肺氧合对撞击伤致急性肺损伤细胞因子表达影响

佟昌慈1,2，柳云恩1,2，张玉彪1,2，施琳1,2，刘颖1,2，刘学磊1,2，丛培芳1,2，

金红旭1,2，高燕1,2，侯明晓1,2

沈阳军区总医院1.急诊科；2.全军重症(战)创伤救治中心实验室及

辽宁省重症创伤和器官保护重点实验室，辽宁 沈阳110016

摘要：目的筛选体外膜肺氧合(ECMO)救治严重创伤导致急性肺损伤的特异细胞因子。方法将20只Beagle犬随机分为正常实验犬组(对照组)；橡皮弹撞击至犬肺损伤模型组(模型组)；橡皮弹撞击至犬肺损伤，机械通气治疗组(机械通气组)；以及橡皮弹撞击至犬肺损伤，ECMO治疗组(ECMO组)。解剖取肺组织提取总蛋白质并应用蛋白芯片检测筛选差异表达的细胞因子。结果在检测的20个细胞因子中，与对照组比较，模型组细胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞生长因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要内在蛋白-1β(MIP-1β)和肿瘤坏死因子RIB(TNF-RIB)表达均增高；机械通气组和ECMO组治疗后上述各细胞因子表达均较治疗前降低，且ECMO组差异更显著，差异有统计学意义(P<0.05)；糖基化终末产物特异性受体(RAGE)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)表达趋势相反；4组集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)表达差异无统计学意义；促红细胞生成素(EPO)和干扰素-γ(IFN-γ)无表达。结论ECMO治疗可改善重症创伤导致急性肺损伤引起的炎症反应，为研究ECMO治疗重症创伤导致急性肺损伤的分子机制提供方向和靶点。

关键词：急性肺损伤；体外膜肺氧合；机械通气；蛋白芯片

车祸、矿山爆破以及坠落等撞击导致的急性肺损伤是致病和死亡的主要因素，严重影响患者的生存率，其治疗方法之一为机械通气，若方法不当则可加重病情[1]。体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation,ECMO)是一种将体内静脉血引流到体外，通过膜肺氧合后变为动脉血后，由驱动泵输送回体内的心肺辅助技术，这种技术可以减轻呼吸和(或)循环衰竭患者的心肺负担，减缓患者心肺损伤的病情发展，延长患者生存时间[2-5]。虽然ECMO的临床研究及应用已有多年，但是ECMO在治疗严重创伤导致急性肺损伤分子机制研究较少。

蛋白质组学是用于分析细胞、组织或体液中蛋白质整体定性定量的研究方法，从蛋白整体水平上研究分析细胞或组织的蛋白质及其相互作用关系。同时，蛋白质组学分析也可以为未知分子机制的研究提供研究方向和靶点[6-8]。蛋白芯片技术是研究蛋白质组学的有效技术之一。本研究利用蛋白芯片技术分析筛选ECMO治疗严重创伤导致急性肺损伤可能的分子机制。

1资料与方法

1.1实验动物及分组20只成年健康Beagle犬，体质量30～34 kg，随机分为4组：对照组(n=5)；模型组(n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型；机械通气组(n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型，采用机械通气治疗；ECMO治疗组(n=5)，橡皮弹撞击至犬肺损伤模型，采用ECMO治疗。所有实验犬均购自于沈阳军区总医院动物实验中心，在沈阳军区总医院动物实验中心饲养，食物及水由动物实验中心提供。

1.2橡皮弹撞击至犬肺损伤模型建立实验犬标准喂养2周，术前12 h禁食不禁水，固定于实验架上，常温条件下18.4 mm橡皮弹5 m距离致胸部创伤。橡皮弹全弹重18.47～19.23 g、飞行弹重8.31～8.72 g、弹丸最大直径18.16～18.83 mm、弹速106～125 m/s、动能(E)59.73 J、比动能(Es)21.69 J/cm2。

1.3机械通气治疗实验犬30 mg/kg戊巴比妥钠静脉注射，麻醉后固定，仰卧在手术台上。F6.0～F8.0气管导管插入并连接呼吸机，呼吸频率15次/min，FiO2为40%，氧浓度1.00%，潮气量20 ml/kg。游离右侧股动脉，采集动脉血标本，肝素化置管后连接多道生理信号采集处理系统。游离左侧股静脉，置管连接三通，连接输液装置。气管插管和Y型管之间连接双向流量压力传感装置，连接多道生理信号采集处理系统，测量气道压力和流量的改变。在整个实验过程中注意麻醉深度，适时适量追加戊巴比妥钠，0.03%的司可林维持实验犬肌松，自主呼吸消失为准。

1.4ECMO治疗术前1 mg阿托品腹腔注射，30 mg/kg戊巴比妥钠静脉注射麻醉实验犬至睫反射消失，固定于手术台上。F6.0～F8.0气管插管，连接简易呼吸器、氧气罐和氮气罐，维持实验犬的呼吸，调节氮气、氧气的浓度比以降低吸入的氧气浓度，将置入的热稀释导管与有创动脉血氧饱和度监测仪和多功能监护仪连结。游离双侧股动脉、股静脉及右侧颈静脉，采用股静脉—颈静脉ECMO模式，实验犬的股静脉插管和颈内静脉插管与ECMO系统相连，按右股静脉-储血器-滚压泵-氧合器-右颈内静脉的顺序连接。激活全血凝固时间(ACT)维持在140～200 s。体外循环开始时，膜肺气血比调至1∶1，氧合器清扫气流为纯氧，流量2～4 L/min。从心排量所能达到的最大值为体外循环血量开始，转流建立后，给予无氧呼吸(全氮气)。维持动脉血氧饱和度(SaO2)在90%时的体外循环血流量。

1.5肺组织标本采集动物实验结束后，利用股动脉放血法处死实验犬，无菌条件下，迅速打开胸腔，右肺门结扎，取出肺组织。取肺上叶分成若干个小部分，放入常规消毒处理后的EP管中，迅速放入液氮罐中，保存于-80℃低温冰箱。

1.6总蛋白提取将冻存在液氮中的肺组织取出后融化，每50～100 mg组织加入0.5 ml组织裂解液，制备成组织匀浆，4 ℃，12 000 r/min离心20 min后，取上层蛋白溶液于新EP管中。

1.7蛋白芯片检测取实验犬肺组织提取全蛋白溶液，采用QAC-CYT-1及QAC-CYT-2蛋白芯片(汇佰生物科技有限公司)，检测细胞因子的表达。

2结果

2.1蛋白芯片筛选细胞因子白介素-2(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞生长因子R(HGF-R)、白介素-1β(IL-1β)、主要内在蛋白-1β(MIP-1β)和肿瘤坏死因子RIB(TNF-RIB)的表达量，模型组明显高于对照组；与模型组比较，机械通气组和ECMO组有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)；ECMO组与机械通气组比较，下降幅度更大，差异有统计学意义(P<0.05)。糖基化终末产物特异性受体(RAGE)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)和白介素-12p40(IL-12p40)的表达量，模型组低于对照组；与模型组比较，机械通气组和ECMO治疗组有一定量的上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与机械通气组比较，ECMO治疗组上升幅度更大，差异有统计学意义(P<0.05)；4组集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)的表达量无明显变化；促红细胞生成素(EPO)和干扰素-γ(IFN-γ)无表达。见表1。

2.2蛋白相互关系检索通过String Database基因/蛋白质相互作用关系检索工具，分析差异表达的蛋白之间的相互作用关系。见图1。

±s,pg/ml)

注：与对照组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05；与机械通气组比较，③P<0.05

图1　蛋白芯片显示差异表达蛋白相互作用

3讨论

急性肺损伤引起的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是致病和死亡的主要因素，严重影响患者的生存率。目前，治疗急性肺损伤和ARDS的方法之一为机械通气，但呼吸机的使用不当反而导致肺损伤及炎症反应的加重[1]。ECMO技术将体内静脉血引流到体外，利用膜肺代替肺功能，氧合血液、排出二氧化碳，将静脉血变为动脉血后再输送回体内，在一定程度上可以代替损伤的肺行使功能，以减轻肺的负担，有利于肺功能的恢复，缓解机体缺氧状态，减缓患者伤势发展[2-5]。但是ECMO治疗并不适合所有患者，有研究表明，ECMO技术对于提高急性肺损伤患者的生存率并没有明显优势[9]。因此，研究ECMO治疗严重创伤导致急性肺损伤的分子机制具有重要意义。

对于分子机制的研究，经典的分子生物学技术只能对其中的一种或几种蛋白进行研究，而不能从蛋白整体水平上分析细胞或组织。蛋白质组学是用于分析细胞、组织或体液中蛋白质整体定性定量的研究方法，使分析整体蛋白质及其相互作用关系成为可能。另外，对于未知分子机制的研究，蛋白质组学分析也可以提供研究方向和靶点[6-8]。蛋白芯片技术是研究蛋白质组学的有效技术之一，在本研究中，我们利用蛋白芯片技术分析筛选ECMO治疗严重创伤导致急性肺损伤可能的分子机制。蛋白芯片检测细胞因子的表达，数据分析结果显示，在20个细胞因子中，有15个表达差异有统计学意义。多项炎症因子的差异表达表明，ECMO治疗重症创伤导致急性肺损伤的可能分子机制是抑制炎症反应，同时为其深入研究提供多个指标。通过String Data base基因/蛋白质相互作用关系检索工具分析15个差异表达的蛋白之间的相互作用关系，发现多个蛋白之间形成复杂的网络关系，这表明重症创伤导致的急性肺损伤引起的炎症反应是一个复杂的过程。

通过蛋白芯片技术初步筛选ECMO治疗重症创伤导致急性肺损伤过程中表达改变的蛋白因子，为研究其机制提供可能的研究方向，同时筛选可能的临床检测指标。

参考文献

[1]周成斌,张镜芳,章晓华,等.体外膜肺氧合对急性肺损伤犬血浆粘附分子的影响[J].中国体外循环杂志,2007,5(1):35-38.

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[3]Le Guen M,Parquin F.The place of extra-corporeal oxygenation in pulmonary diseases[J].Rev Mal Respir,2015,32(4):358-369.

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[6]Stunnenberg HG,Hubner NC.Genomics meets proteomics:identifying the culprits in disease[J].Hum Genet,2014,133(6):689-700.

[8]Abel L,Kutschki S,Turewicz M,et al.Autoimmune profiling with protein microarrays in clinical applications[J].Biochim Biophys Acta,2014,1844(5):977-987.

[9]Mols G,Loop T,Geiger K,et al.Extracorporeal membrane oxygenation:a ten-year experience[J].Am J Surg,2000,180(2):144-154.

·体外膜肺氧合·

第一作者：佟昌慈(1988-)，女，辽宁抚顺人，技师，硕士

Effect of extracorporeal membrane oxygenation on the expression of cytokines in acute lung injury induced by impact injury

TONG Chang-ci，LIU Yun-en，ZHANG Yu-biao，SHI Lin，LIU Ying，LIU Xue-lie，CONG Pei-fang，JIN Hong-xu，GAO Yan，HOU Ming-xiao(Department of Emergency Medicine,and Laboratory of PLA Wound and Trauma Center,The General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the specific cytokines in the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of extracorporeal membrane oxygenation(ECMO).MethodsTwenty beagle dogs were randomly divided into 4 groups:normal control group,model group,mechanical ventilation treatment group,and ECMO treatment group.Rubber bullets hit to the canine model of lung injury.To extract total protein of the lung tissue,proteinchip assayed and screened differentially expressed cytokines.ResultsIn the detection of the 20 cytokines,compared with the control group,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,MCP-1,SCF,HGF and HGF R,IL-1B,MIP-1βand TNF RI B of model group,expressed increasingly,which decreased after mechanical ventilation and ECMO treatment,and the difference of ECMO treatment was more obvious.The expression tendency of VEGF,FGF-7 and IL-12p40 were opposite.The expression of GM-CSF,TNF alpha and IL-17A had no significant difference.EPO and IFNγhad no expression.ConclusionECMO treatment can improve the inflammatory response caused by severe trauma induced acute lung injury,and provide direction and target for the subsequent study of molecular mechanism of the acute lung injury caused by severe trauma with the treatment of ECMO.

Key words:Acute lung injury;Extracorporeal membrane oxygenation;Mechanical ventilation;Protein chip

收稿日期：2015-08-30

DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2016.01.02

文章编号：2095-5561(2016)01-0006-04

中图分类号：R563.9；R654.1

文献标志码：A

通信作者：侯明晓，E-mail:houmingxiao188@163.com

基金项目：2012年辽宁省科技攻关(201122007)；2012年全军“十二五”面上项目(CSY12J002)；2013年全军“十二五”面上延续项目(CSY13J003)