高效液相色谱法同时测定大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量

陈群力，周淑琴，须　冰，吴　飞

(1.上海健康医学院，上海　201318；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肾内科，

上海　200437；3.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海　201203)



高效液相色谱法同时测定大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量

陈群力1，周淑琴1，须冰2，吴飞3

(1.上海健康医学院，上海201318；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肾内科，

上海200437；3.上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心，上海201203)

摘要：目的建立高效液相色谱法(HPLC)用于同时测定大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量。方法色谱柱为Agilent Zorbax SB C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相为乙腈-1.7%磷酸溶液(23∶77)等度洗脱，流速1.0 mL·min-1，柱温25 ℃，检测波长275 nm。结果丹酚酸B和淫羊藿苷分别在0.104 4～6.892 μg和0.079 1～2.966 μg 范围内线性良好，平均加样回收率分别为102.7%和98.89%。结论 建立的方法专属性强、重复性好、结果准确可靠，可用于大黄灵脾颗粒的质量控制和评价方法。

关键词：大黄灵脾颗粒；丹酚酸B；淫羊藿苷；高效液相色谱法；测定

大黄灵脾颗粒是由丹参、大黄、淫羊藿等多味中药组成的医院制剂，具有温阳活血、泻浊解毒的作用，主要用于慢性肾功能衰竭的治疗，在上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院的长期临床应用证实其疗效显著，能明显延缓肾衰的发展[1-3]。方中淫羊藿和丹参均作为君药使用，淫羊藿作为常用的中药补阳药，具有增强免疫、抑菌抗炎和保护心脑血管等广泛的药效作用；丹参所含的水溶性指标性成分为丹酚酸B，具有抗氧化、抗纤维化和抑制血管上皮细胞坏死作用[4]，但是现行质量标准未对该制剂进行相应的定性或定量控制[5]。因此，为了提高产品的质量控制水平，确保其临床疗效，本研究建立了同时测定大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷含量的HPLC测定方法，为其质量标准提高提供研究基础。

1仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪，含四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器和Agilent ChemStation色谱工作站(美国安捷伦公司)；MS105DU分析天平(0.01 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司)；FA2104N分析天平(0.1 mg，上海精密科学仪器有限公司)；SK5200超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；Milli-Q型超纯水制备仪(密理博中国有限公司)。

丹酚酸B对照品(批号：111562-201212，中国食品药品检定研究院)；淫羊藿苷对照品(批号：110737-200415，中国食品药品检定研究院)；大黄灵脾颗粒3批(批号分别为140626、140712和140828，均为上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供)；磷酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司)；水(自制超纯水)。

2方法与结果

2.1色谱条件 Agilent Zorbax C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈—1.7%磷酸溶液(23∶77)为流动相，流速为1.0 mL·min-1，柱温25℃，检测波长275 nm，进样量10 μL。

2.2溶液制备

2.2.1对照品溶液的制备精密称取丹酚酸B 和淫羊藿苷对照品对照品适量，分别加75%甲醇溶液稀释成1.044 g·L-1丹酚酸B的对照品溶液母液和0.494 4 g·L-1淫羊藿苷的对照品溶液母液；精密吸取0.5 mL丹酚酸B对照品溶液母液和0.8 mL淫羊藿苷对照品溶液母液至10 mL容量瓶内，加75%甲醇稀释，得到含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的对照品溶液；再精密移取3.3 mL丹酚酸B对照品母液和3.0 mL淫羊藿苷对照品母液于10 mL容量瓶中，加75%甲醇稀释制成含丹酚酸B 344.6 mg·L-1和淫羊藿苷148. 3 mg·L-1的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL稀乙醇，称重，密封，超声30 min，冷却后补足失重，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3阴性样品的制备按照工艺[5]实验室制备缺淫羊藿和丹参的阴性样品。取阴性样品适量，按照“2.2.2”项下方法操作，制得大黄灵脾颗粒阴性样品。

2.3方法学考察

2.3.1专属性分别精密移取含淫羊藿苷和丹酚酸B对照品溶液、大黄灵脾颗粒供试品和大黄灵脾颗粒阴性样品10 μL，在上述色谱条件下进样分析，结果显示阴性样品不干扰丹酚酸B(tR=18.0 min)和淫羊藿苷(tR=38.0 min)的测定，色谱图见图1。

图1　丹酚酸B和淫羊藿苷含量测定色谱图

注：A:丹酚酸B和淫羊藿苷对照品； B:大黄灵脾颗粒样品；C:阴性样品(缺淫羊藿和丹参)；1. 丹酚酸B；2. 淫羊藿苷。

2.3.2线性关系的考察精密称取丹酚酸B和淫羊藿苷对照品适量，制成含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的对照品溶液a和含丹酚酸B 344.6 mg·L-1和淫羊藿苷148. 3 mg·L-1的对照品溶液b。精密吸取对照品溶液a 2.0、4.0、8.0、15.0、20.0 μL和对照品溶液b 10.0、15.0、20.0 μL，分别注入色谱仪，记录峰面积，以峰面积对进样量(μg)进行线性回归，分别得到丹酚酸B和淫羊藿苷对照品的回归方程(见表1)。结果表明：丹酚酸B和淫羊藿苷在0.104 4～6.892 μg和0.079 1～2.966 μg 范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.3.3精密度试验精密吸取含丹酚酸B 52.2 mg·L-1和淫羊藿苷39.55 mg·L-1的对照品溶液10 μL，重复进样6次。结果丹酚酸B和淫羊藿苷峰面积RSD分别为0.3%和0.3%，表明进样精密度良好。

表1　线性关系考察结果

2.3.4重复性试验取大黄灵脾颗粒(批号140626)，按“2.2.2”项下方法测定，重复测定6份，计算样品中丹酚酸B和淫羊藿苷的平均含量分别为0.663 mg·g-1和0.493 mg·g-1，RSD分别为1.0%和1.1%，结果表明样品测定重复性良好。

2.3.5稳定性试验取大黄灵脾颗粒(批号140626)，按“2.2.2”项下方法测定，于0、2、4、6、8和12 h进样测定，丹酚酸B和淫羊藿苷的RSD分别为1.1%和0.3%，结果表明在12 h内供试品溶液基本稳定。

2.3.6加样回收率试验取已知含量的供试品1.0 g(批号140626，丹酚酸B和淫羊藿苷的含量分别为0.663 mg·g-1和0.493 mg·g-1)9份，精密称定，置锥形瓶中，分别精密加入浓度为1.044 g·L-1的丹酚酸B对照品溶液0.5 mL(低浓度)、0.6 mL(中浓度)和0.7 mL(高浓度)，以及浓度为0.494 4 g·L-1的淫羊藿苷对照品溶液0.8 mL(低浓度)、1.0 mL(中浓度)和1.2 mL(高浓度)，按“2.2.2”项下方法测定。回收率结果见表2和表3。结果表明，此方法丹酚酸B和淫羊藿苷的的平均回收率为102.7%和98.89%，符合要求。

表2　丹酚酸B加样回收率试验结果

表3　淫羊藿苷加样回收率试验结果

2.4样品测定取大黄灵脾颗粒3批，按照“2.2.2”项下方法测定丹酚酸B和淫羊藿苷的含量，结果见表4。

3讨论

本研究首次建立了中药复方制剂大黄灵脾颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷同时测定的HPLC方法，前处理简单，分析时间短，方法学合格。所建立的定量测定方法与原质量标准配合(对大黄素进行定性鉴别)[5]，可以大幅度提升制剂的质量控制水平，从而保证制剂的临床疗效。

表4　3批颗粒中丹酚酸B和淫羊藿苷含量(n=3)

中药院内制剂多源自于民间方、古方，是医生经过多年临床应用所形成的经验方的制剂，应用广泛，疗效显著。由于院内制剂的质量控制水平较低，化学控制指标不足，多缺少定量控制指标[6-7]。丹参和淫羊藿均是方中君药，选择丹酚酸B和淫羊藿苷作为大黄灵脾颗粒的质量控制指标是合理的。现代研究发现，不同植物来源、不同产地的丹参、淫羊藿中丹酚酸B和淫羊藿苷成分有较大的差异[8-9]。

样品前处理中考察了提取溶剂和处理方法，显示丹酚酸B和淫羊藿苷用稀乙醇提取较甲醇、乙醇和水提取效率高，加热回流提取效果与超声提取效果相当。鉴于丹酚酸B热不稳定的特点[10]，在加热回流条件下其含量可能会有一定程度的下降。综合考虑，采用以稀乙醇为溶媒，进行超声提取，同时通过对提取时间进行考察，确定超声提取30 min即可将样品中丹酚酸B和淫羊藿苷提取完全。

中药制剂中对丹酚酸B、淫羊藿苷的含量测定方法已有较多报道[11-20]，但是由于大黄灵脾颗粒的处方组成药味较多，化学组分复杂，杂质易干扰目标成分的准确定量测定。通过全波长扫描发现丹酚酸B、淫羊藿苷的最大吸收波长分别为286 nm和270 nm，考察了这两个组分在不同波长条件下的吸收值，最后选择对这两个组分均有较大吸收的275 nm作为检测波长。考察了不同比例流动相甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)、 乙腈-1.7%醋酸(23∶77)和乙腈-1.7%磷酸(23∶77)以及柱温的影响，最后确定了实验色谱条件。采用乙腈-1.7%磷酸溶液(23∶77)为流动相可以取得较好效果，在该色谱条件下，丹酚酸B和淫羊藿苷色谱分离度好，峰对称性好，阴性无干扰，与药典采用的甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)三元混合流动相相比，本方法对仪器的要求较低，具有一定的实用价值。

参考文献：

[1]陈敏,徐艳秋,须冰,等.大黄灵脾颗粒剂对慢性肾衰大鼠肾功能恶化进程的影响[J].中国实验方剂学杂志, 2009,15 (2): 68-70.

[2]吴志英,张天,薛波.大黄灵脾汤对慢性肾功能衰竭患者细胞免疫功能的影响[J].中国中西医结合杂志, 1994, 14(增刊51): 52-55.

[3]周筱静,郑平东.大黄灵脾汤治疗慢性肾功能不全的实验研究[J].上海中医药杂志,1996(4): 12-15.

[4]何立群.丹酚酸B对马兜铃酸诱导的大鼠肾纤维化的拮抗研究[J].上海中医药杂志,2007,41(7):3-5.

[5]上海市食品药品监督管理局医疗机构制剂质量标准[S],SYZ-ZF-151-2005.

[6]朱文涛,卢双.浅谈中药院内制剂存在价值[J]. 中医药管理杂志, 2009, 17(4): 347-348.

[7]李哲,常暖,李黎.中药院内制剂政策历史、现状及对策[J]. 中国中医药图书情报杂志,2014,38(1): 38-41.

[8]邓寒霜,李筱玲,王凯.不同产地丹参饮片质量研究[J]. 时珍国医国药, 2009, 20(12): 3105.

[9]徐玲玲,黄礼杰,顾国献.不同产地和品种淫羊藿中淫羊藿苷的HPLC分析[J]. 中国现代应用药学,2000,17(2): 110-113.

[10] 倪力军,邬科芳,张立国.加热方式对丹酚酸物质的量的影响[J]. 中药新药与临床药理, 2006, 17(1): 55-57.

[11] 涂兴明,李赐恩,吴康郁.高效液相色谱法测定骨康口服液中芍药苷的含量[J].中药新药与临床药理,2013, 24(6): 613-615.

[12] 林生文,李瑞明,陈孝,等.高效液相色谱法测定丹墨胶囊中丹酚酸B含量[J].中国药业, 2011, 20(21): 20.

[13] 赵小伟,车晓平,李卫敏,等.三参通脉颗粒质量标准研究[J]. 北京中医药, 2011, 30(11): 862.

[14] 于晶晶,徐飞鹏. RP-HPLC同时测定香丹注射液中丹参素钠、原儿茶醛和丹酚酸B的含量[J]. 海峡药学, 2012, 24(2): 45.

[15] 刘文琴. HPLC测定心舒颗粒中丹酚酸B的含量[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(23): 2572．

[16] 张化然. HPLC法测定天王补心丸中丹酚酸B的含量[J].安徽医药, 2007, 11(10): 889-890.

[17] 于霞,金向群,马晨光. HLPC测定清肝芩栀胶囊中的黄芩苷和丹酚酸B[J]. 华西药学杂志, 2007, 22(5): 562-563.

[18] 刘元,莫海涛,宋志钊,等. HPLC法测定千斤脑康宁胶囊中丹酚酸B的含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(4): 37.

[19] 李世杰,付红,曲银锋.宁神补心片的质量标准研究[J].中国药业, 2011, 20(16): 42-44.

[20] 任亚东,施猛,孙秋艳,等.HPLC法测定正元胶囊中淫羊藿苷的含量[J]. 亚太传统医药, 2014, 10(11): 16-18.

◇药物分析◇

Determination of Salvianolic acid B and Icariin in

Dahuanglingpi Granules by HPLC

CHEN Qun-li1, ZHOU Shu-qin1, XU Bin2,et al

( 1.ShanghaiUniversityofMedicineandHealthSciencesShanghai201318,China;

2.DepartmentofNephrology,YueyangHospitalofIntegrativeChineseandWesternMedicineAffiliatedto

ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200437,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of salvianolic acid B and icariin in Dahuanglingpi granules. MethodsThe separation was carried on an Agilent Zorbax SB C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) and acetonitrile-1.7% phosphoric acid solution(23 ∶77) was employed as the mobile phase. The flow rate was 1.0 mL·min-1with UV detection wavelength at 275 nm and the column temperature was 25℃. ResultsThe linear range of salvianolic acid B and icariin were 0.104 4～6.892 μg and 0.079 1～2.966 μg, respectively. The average recoveries were 102.7% and 98.89%. Conclusion The method is simple and accurate with good specificity and reproducibility, and it can be used for the quality control and evaluation of Dahuanglingpi granules.

Key words：Dahuanglingpi granules；salvianolic acid B；icariin；HPLC；determination

收稿日期：(2015-09-11，修回日期：2015-11-02)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.013

通信作者：须冰，女，主任医师，研究方向：中医药治疗肾脏病，E-mail: x-u-bing@hotmail.com

基金项目：上海优秀青年教师扶助基金项目(No B010310009)；上海市科委重点科技攻关项目(No 11DZ1972003)