苯并芘对孕早期小鼠胎盘绒毛组织的影响及槲皮素的防护作用机制

高秀霞，侯海燕，孔祥玲，刘传丽

(武警后勤学院附属医院妇产科，天津　300162)



苯并芘对孕早期小鼠胎盘绒毛组织的影响及槲皮素的防护作用机制

高秀霞，侯海燕，孔祥玲，刘传丽

(武警后勤学院附属医院妇产科，天津300162)

摘要：目的研究苯并芘(BaP)损伤小鼠胎盘绒毛组织细胞作用机制及探讨槲皮素(ME)的防护机制。方法选取性成熟ICR小鼠150只(100只雌鼠、50只雄鼠)，随机分为5组，每组30只(20只雌鼠、10只雄鼠)，雌雄分开饲养，A组予BaP(2 mg·kg-1·d-1)；B、C、D组予BaP(2 mg·kg-1·d-1)的同时分别灌胃ME(0.5、1、2 g·kg-1·d-1)；E组灌胃相同体积的0.9%氯化钠注射液与橄榄油。连续灌胃15 d后雌雄鼠同笼，第2天发现精液栓者为受孕，挑出受孕小鼠继续灌胃7 d后处死，取胎盘组织测定Bax与Bcl-2基因mRNA水平的表达、细胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果总共45只小鼠受孕，各组间受孕率无统计学差异(χ2=0.808，P=0.937)，B、C、D组Bax基因mRNA水平表达高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加表达量逐渐降低(P<0.05)；B、C、D组Bcl-2基因mRNA水平表达低于E组(P<0.05)，高于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加表达量逐渐升高(P<0.05)；B、C、D组中细胞色素P450酶活性明显高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加活性逐渐降低(P<0.05)；B、C、D组中GSH-PX、SOD活性明显低于E组(P<0.05)，高于A组(P<0.05)，且随着剂量的增加活性逐渐升高(P<0.05)。结论ME能通过提高抗氧化酶活力与抑制凋亡基因表达来保护苯并芘所致的胎盘绒毛组织细胞损伤，提高生育能力。

关键词：苯并芘；槲皮素；胎盘绒毛组织；凋亡

苯并芘(Benzo[a]pyrene,BaP)是多环芳烃类化合物(polycyclic aromatic hydrocarbon compounds，PAHs)中的代表，形成于能源物质与肉类食物的不完全燃烧，近年来随着城市汽车数量逐年提高、烧烤类食物的大量使用，BaP能导致细胞发生凋亡，其致凋亡机制是通过肝脏代谢过程中经细胞色素P450酶作用而产生大量氧化性极强的中间产物二氢二醇环氧苯并芘(BaP-7,8-Dihydrodiol-9,10-Epoxide，BPDE)与大量的氧自由基[1]。胎盘是母体与胚胎进行物质交换的场所，功能降低后影响胚胎发育，Detmar等[2]通过大鼠暴露于低浓度的BaP研究显示，BaP诱发凋亡是通过增加胎盘与胎膜内皮细胞上的凋亡相关基因的表达来实现的。其致凋亡具体路径是其与DNA形成加合物后作用于芳香烃受体(Ary1 hydrocarbon receptor，AhR)，进一步活化Bax基因发达而发挥作用[3]。

槲皮素(meletin，ME)属于黄酮类物质中的一种，微溶于水，易溶于热乙醇、乙醚等有机溶剂，是黄酮类化合物中的代表物质，抗氧化能力强，长期服用降低恶性肿瘤的发生率[4]。本实验组已经证实维生素E能抑制BaP所诱导的胎盘绒毛组织凋亡[5]，而ME是否能抑制BaP所诱导的胎盘绒毛组织凋亡及其保护作用机制，需要我们去深入研究。

1实验方法

1.1实验动物的选择、分组及处理将150只ICR性成熟小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司提供，周龄6～8周，体质量30～34 g，合格证号SCXK-(京)2012-0002]用随机数字法分为A、B、C、D、E 5组，每组均为30只(雌鼠20只、雄鼠10只)，雌、雄鼠分开饲养，饲养温度控制在20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，颗粒饲料喂养(雌鼠给予高蛋白饲料)，自由饮水饮食。A组：BaP(2 mg·kg-1·d-1)；B组：ME(0.5 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；C组：ME(1.0 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；D组：ME(2.0 g·kg-1·d-1)+BaP(2 mg·kg-1·d-1)；E组：相同体积的0.9%氯化钠注射液与橄榄油(初榨橄榄油为西班牙品利公司产品)。BaP(美国Sigma公司产品)用橄榄油配成混悬液、ME(美国Sigma公司产品)用0.9%的生理盐水配成混悬液，两种制剂均配好后避光4℃保存，现用现配。将100只雌鼠连续灌胃15 d后与雄鼠同笼，第2天发现有精液栓为怀孕第1天(见图1)[6]，将已受孕的小鼠按上述方法再连续灌胃7 d(ICR小鼠孕周期为20 d，早孕为7 d[6])，最后一次灌胃后处死(颈椎脱臼法)小鼠立即放于冰台(-4～0 ℃)上，无菌条件下取出胎盘组织，检测相关指标。

图1　小鼠精液栓图片

1.4GSH-PX、SOD酶活性测定将取出的胎盘组织用匀浆机以(10 000～15 000 r·min-1)在4 ℃下匀浆(每次匀浆时间10 s、间隙30 s、连续3～4次)，按试剂盒说明称取组织后先测定蛋白含量(双缩脲法)再按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD活性(试剂盒为南京建成生物技术公司产品)，测定时采用生物分光光度计(BioPhotometer型为德国Eppendorf公司产品)测定并按照公式计算出活性值，均在1周内测定。

1.5HE染色观察胎盘绒毛组织细胞将取出的新鲜胎盘组织用0.9%的NaCl溶液冲洗干净后浸泡于10%的多聚甲醛中(美国Sigma公司)，石蜡包埋后制成石蜡切片(德国Leica公司)，将石蜡块按5 μm的厚度切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，每隔10张切片染色一张。将切片在40℃水中展平，平铺于载玻片上。将载玻片放入60℃烤箱中烤片，按照试剂盒(天津灏洋生物制品科技公司)说明进行进行染色，封片后在显微镜下进行观察，进行400×的显微照相。

1.6统计学分析采用SPSS17.0软件进行资料分析。计数资料的组间比较采用χ2检验；计量资料则采用单因素方差分析+两两多重比较。以P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1各组受孕例数统计A组成功受孕8只(40%)、B组成功受孕8只(40%)，C组成功受孕9只(45%)、D组成功受孕10只(50%)、E组成功受孕10只(50%)，总受孕45只(45%)，A、B2组受孕率低于C、D、E 3组，但无统计学差异(χ2=0.808，P=0.937)，结果见表1。

2.2ICR小鼠胎盘绒毛组织凋亡相关基因Bax、Bcl-2基因mRNA水平表达BaP(2 mg·kg-1·d-1)能导致小鼠胎盘绒毛组织的Bax基因mRNA水平升高，使Bcl-2基因mRNA水平降低，A组小鼠胎盘绒毛组织Bax基因mRNA水平表达明显高于E组(P<0.05)，B、C、D组Bax基因mRNA水平表达高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加表达量逐渐降低(P<0.05)；A组胎盘绒毛组织的Bcl-2基因mRNA水平表达量明显低于E组(P<0.05)，B、C、D组Bcl-2基因mRNA水平表达低于E组(P<0.05)，高于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加表达量逐渐升高(P<0.05)；A组小鼠胎盘绒毛组织Bax/Bcl-2比值明显高于E组(P<0.05)，B、C、D组Bax/Bcl-2比值高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加比值逐渐降低(P<0.05)，两基因mRNA水平表达量间呈负相关性(r=-0.825，P=0.021<0.05)，结果见图2、表2。

表1　ICR小鼠受孕情况比较

图2　Bax、Bcl-2基因相对GAPDH基因的

分组数量/只IODBaxBcl-2Bax/Bcl-2A81.12±0.170.39±0.062.87±0.22B80.98±0.12a0.51±0.07a1.92±0.06aC90.88±0.09ab0.58±0.07ab1.52±0.12abD100.60±0.08abc0.64±0.08abc0.94±0.06abcE100.42±0.07abcd0.75±0.09abcd0.56±0.06abcdF10.5489.53917.564P0.0040.0010.002

注: 与A组比较，aP<0.05；与B组比较,bP<0.05；与C组比较,cP<0.05；与D组比较,dP<0.05。

2.3HE染色观察坏死细胞与凋亡细胞情况HE染色400倍光镜下法观察出现核固缩、核碎裂、核溶解、细胞膜皱缩、破裂的细胞，从图3中可以看出，A组中发生细胞核固缩与溶解、细胞形态异常的细胞数量明显高于其他四组，其中E组发生上述改变的细胞数量较少，明显少于其他四组。

图3　胎盘绒毛组织细胞凋亡情况(HE×400)

2.4P450、GSH-PX、SOD酶活性B、C、D组中细胞色素P450酶活性明显高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加活性逐渐降低(P<0.05)；B、C、D组中GSH-PX、SOD活性明显低于E组(P<0.05)，高于A组(P<0.05)，且随着剂量的增加活性逐渐升高(P<0.05)，结果见表3。

表3　ICR小鼠胎盘绒毛组织CYP450、

注: 与A组比较，aP<0.05；与B组比较,bP<0.05；与C组比较,cP<0.05；与D组比较,dP<0.05。

3讨论

ME主要来源于姜科植物山奈的根茎，有些水果、蔬菜中也含有山奈酚，目前很多实验室已从茶叶、蜂胶、柚子等植物中提取到它的纯品，银杏黄酮的有效成分为槲皮和素山奈酚，中老年人常服用一些以银杏提取物为活性成分药物，有一定的抑癌功效[8]。因黄酮类物质除了有较强的抗氧化能力外还能降低BaP所有诱导的CYP450活性增强是其他抗氧化剂所没有的，这样就可以降低代谢产物BPDE的产生，降低氧化损伤[9]，因此选择ME对抗BaP氧化损伤。

Bax基因本身发挥凋亡作用必须与Bcl-2基因配合才能完成，当Bax形成同源二聚体时发挥促进凋亡作用，当Bcl-2基因表达量升高，而与Bcl-2基因结合形成异源二聚体，发挥抑制凋亡作用[10]。本实验通过RT-PCR法对胎盘绒毛组织Bax与Bcl-2两基因的mRNA水平进行半定量测定。结果进一步证实BaP能通过升高胎盘绒毛组织Bax基因mRNA表达量与降低Bcl-2基因mRNA表达量而诱导胎盘绒毛组织细胞发生凋亡(从图 3中可以看出，A组中发生细胞核固缩与溶解，细胞形态异常的细胞明显高于其他四组，其中E组发生上述改变的细胞数量较少，明显少于其他四组)，BaP可使Bax/Bcl-2 mRNA水平比值升高，而ME (0.5、1、2 g·kg-1·d-1)可通过降低Bax基因蛋白与mRNA表达量并升高Bcl-2基因蛋白与mRNA表达量而抑制细胞凋亡，且ME2 g·kg-1·d-1抑制效果最强，且两基因mRNA水平表达量间呈负相关性(r=-0.825，P=0.021<0.05)。

其中CYP450酶是一个大家族，CYP450家族成员目前已知有14个，人体内有30个同功酶，主要分布于肝脏，参与药物与毒物的代谢，一般发挥解毒效应，但在有些条件下代谢产物毒性较强，代谢BaP过程就主要发挥增毒效应，BaP在肝脏中的CYP450酶作用过程中产生大量活性氧物质造成过氧化损伤，该酶活性强弱在染毒早期反应其染毒程度强弱，染毒程度越高活性越强，而晚期该酶耗尽，活力降低[11]。结果显示：B、C、D组中细胞色素P450酶活性明显高于E组(P<0.05)，低于A组(P<0.05)，且随着ME的剂量增加活性逐渐降低(P<0.05)，朱淑萍等[12]通过妊娠早期大鼠BaP灌胃致畸胎动物模型证实大鼠孕早期经BaP毒染能使胎盘绒毛组织中CYP450活性升高，而晚期活性降低，本实验结果与朱淑萍等[12]研究结果相同。而针对抗氧化酶系统(GSH-PX与SOD)结果显示：B、C、D组中GSH-PX、SOD活性明显低于E组(P<0.05)，高于A组(P<0.05)，且随着剂量的增加活性逐渐升高(P<0.05)，此外也有研究显示：GSH-PX与CYP450两酶的活性反应了机体抗氧化与氧化之间是否平衡。PAHs是经过Ⅰ相酶(CYP1A1)与细胞大分子反应而增强活性或通过Ⅱ相酶(GSTM1)代谢作用而形成解毒效应，经Ⅰ相酶代谢后对机体有氧化损伤作用，而经Ⅱ相酶代谢后对机体有益处，两基因表达量大小直接影响CYP450、GSH-PX酶活性[9,13]。本实验结果显示：经BaP染毒后小鼠胎盘组织的GSH-PX活力降低，CYP450活性升高，而给予槲皮素干预后GSH-PX活力升高，CYP450活性降低，与以往结果相同[9,13]。本实验仅仅针对妊娠期间胚胎对外界环境污染物最为敏感的早期进行了研究，针对中期及其晚期还未研究，本实验组将在今后的实验去进一步论证。

关于苯并芘对ICR小鼠受孕率的结果显示：总受孕率45%，且A、B两组受孕率低于C、D、E三组，但无统计学差异(χ2=0.808，P=0.937)，可能与本实验所选用的小鼠数量较少有关。

本实验证实了ME能升高胎盘绒毛组织抗氧化酶活性并且降低细胞色素P450酶活性，很好的纠正氧化与抗氧化失衡，并能很好的降低Bax基因mRNA水平的表达，升高Bcl-2基因mRNA水平的表达来抑制凋亡，而ME是否能像维生素E一样应用于妊娠前期与妊娠期妇女的日常保健而预防不良妊娠结局的发生，值得我们去进一步临床研究，本实验结果为今后的妊娠期保健提供了一定的理论基础。

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Effect of BaP on placental villus injury in early pregnant mice and

the protective mechanism of meletin against BaP

GAO Xiu-xia，HOU Hai-yan, KONG Xiang-ling, et al

(DepartmentofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedHospitalofArmed

PoliceLogisticsInstitute,Tianjin300162,China)

Abstract：ObjectiveTo study the action of injury that BaP acts on placental villus of early pregnant mice and the mechanism of meletin opposing BaP. MethodsTotally 150 viripotent ICR mice(100 female mice, 50 male mice) were randomized into five groups, every group including 30 mice(20 female mice,10 male mice). Female and male mice were raised respectively, mice in group A were lavaged with BaP (2 mg·kg-1·d-1) , mice in group B, C, D lavaged with BaP(2 mg·kg-1·d-1) and ME(0.5,1.0,2.0 g·kg-1·d-1respectively), mice in group E lavaged with normal saline(0.9%) plusolive oil. After 15days, male mice were mated with female mice. Pregnancy was determined the next day based on the presence of a vaginal plug, then lavaging continued for another 7 days. The mice were euthanized for the detection of Bax and Bcl-2 mRNA levels and the activity of cytochrome 450,GSH-PX and SOD in placental villus. ResultsThe total pregnancy rate was 45%, and the pregnancy rate had no statistical difference(χ2=0.808,P=0.937).Bax mRNA levels were higher in group B, C, D than in group E (P<0.05), while lower than in group A (P<0.05). With the increase of ME dose, the expression of Bax mRNA decreased (P<0.05);Bcl-2 mRNA levels were lower in group B, C, D than in group E (P<0.05), while higher than in group A (P<0.05). With the increase of ME dose, the expression of Bcl-2 mRNA increased (P<0.05). The activity of cytochrome P450 in group B,C,D was greater than in group E , while lower than in group A(P<0.05). With the increase of ME dose, the activity of cytochrome P450 decreased(P<0.05). The activity of GSH-PX,SOD in group B,C,D was lower than in group E , while greater than in group A(P<0.05). With the increase of ME dose, the activity ofGSH-PX,SOD increased(P<0.05). ConclusionMeletin can protect the mice against placental villus injury by raising the activity of antioxidase and suppressing the cell apoptosis in the placental villus .

Key words：BaP; meletin; placental villus; apoptosis

收稿日期：(2015-07-28，修回日期：2015-09-18)

基金项目:天津市应用基础与前沿技术研究计划(No 15JCQNJC 2300)；天津市自然科学基金资助项目(No 07J CZDJC07400)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.01.005